论文部分内容阅读
背景:肾缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury,IRI）是指肾组织在缺血基础上恢复血流供应后,组织损伤未能得到修复反而加重的现象,是导致临床上急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）的重要原因之一。AKI是临床上的危急重症,是导致慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）和终末期肾病（End-Stage Renal Disease,ESRD）的危险因素,因此,减轻肾IRI带来的损害具有重要意义。目前定义AKI的诊断标准为以下任一项:48小时内血肌酐（Serum Creatinine,Scr）升高绝对值≥26.5μmol/L;或前7天内Scr较前升高>50%;或6小时尿量≤0.5 ml/kg/h。导致肾IRI常见临床因素有肾移植术、急性缺血性肾功衰、冲击波碎石、体外肾实质切开取石等。缺血再灌注（ischemia reperfusion,I/R）涉及一系列复杂的病理生理过程,主要包括:氧化应激和脂质过氧化、细胞内钙蓄积、线粒体功能障碍、炎症介质和细胞因子等,其中钙超载是肾IRI重要机制之一。越来越多证据表明经典瞬时受体电位（Transient Receptor Potential Canonical,TRPC）通道6可能参与靶器官I/R后的细胞损伤。TRPC6在肾脏足细胞内富集,是足细胞裂孔膜的重要组成部分。TRPC6的异常表达与局灶性节段性肾小球硬化症（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）,糖尿病肾病等密切相关。肾I/R后TRPC6蛋白表达上调,并参与足细胞对缺血损伤反应。肾小管上皮细胞（Tubular Epithelial Cell,TEC）由于其高代谢的生理特点,易受缺血缺氧因素影响,目前认为TEC损伤在肾I/R过程中占据关键地位。本实验室前期结果证实敲除或药物抑制TRPC6能在双氧水（Hydrogen peroxide,H2O2）导致的TEC损伤中发挥保护性作用。本研究进一步利用I/R在体模型及原代肾TEC体外缺氧复氧模型（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）研究TRPC6在TEC损伤中作用。目的:本研究利用野生型（wild type,WT）和TRPC6基因敲除(Trpc6-/-)小鼠建立肾I/R模型（在体）,利用原代培养的TEC建立H/R模型（离体）,探讨TRPC6在I/R损伤中的作用及机制。方法:利用WT和Trpc6-/-小鼠,采用双侧肾蒂夹闭法缺血40 min,再灌注24 h,建立肾脏I/R模型（在体）;利用原代TEC缺氧24 h复氧24 h建立H/R模型（离体）模拟体内I/R损伤。利用全自动生化仪检测Scr、尿素氮（Blood Urea Nitrogen,BUN）生化指标;肾组织病理学苏木素伊红（Hematoxylin Eosin,HE）染色、糖原染色（Periodic Acid-Schiff Stain,PAS）观察肾脏组织形态变化。利用Western blot、免疫荧光、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1）检测TEC凋亡变化。结果:1.I/R后,Scr和BUN均升高。2.Western blot和免疫荧光显示,I/R和H/R后TEC TRPC6蛋白表达增加。3.Western blot显示,I/R和H/R后TEC Cleaved Caspase3（cleaved cysteinyl apspartate specific活化的半胱氨酸天冬蛋白水解酶-3 CC3）,Bax/Bcl-2增加。4.Western blot和免疫荧光显示,I/R和H/R后,Trpc6-/-组较WT组CC3,Bax/Bcl-2降低。5.JC-1染色显示,Trpc6-/-组较WT组在H/R后原代TEC线粒体膜电位的降低减少。6.I/R后,Trpc6-/-组比WT组Scr和BUN均降低。7.HE和PAS染色,WT-SHAM和Trpc6-/--SHAM组肾脏组织结构清晰,TEC排列紧密未见异常。WT-I/R组TEC排列紊乱,大量细胞出现明显肿胀,空泡变性,细胞刷状缘脱落,管腔可见明显管型,间质充血;Trpc6-/--I/R组TEC轻微肿胀,细胞破坏明显减少,变性轻微,偶见少量管型。8.Trpc6-/-组I/R介导的p-AKT和p-ERK1/2蛋白增加水平较WT组降低。分别加入抑制剂U0126和MK2206后,凋亡蛋白表达减少。结论:本实验结果表明,I/R通过激活TRPC6引起钙内流,进而上调PI3K/AKT及ERK信号通路促进凋亡;而Trpc6-/-则可下调PI3K/AKT及ERK通路活性,减轻TEC钙超载,降低TEC凋亡率,从而减轻肾脏IRI。