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目的:1.探讨扶正抗癌方对非小细胞肺癌A549、PC9、H1650细胞株侵袭、迁移的影响,并进一步在基因和蛋白质水平探讨其可能的分子机制;2.探讨扶正抗癌方对非小细胞肺癌吉非替尼原发性耐药细胞株A549和继发性耐药细胞株H1650增殖的影响,及其协同吉非替尼对细胞增殖的影响,并进一步在基因和蛋白质水平上探讨其可能的分子机制;3.建立裸鼠皮下移植瘤模型,进一步验证扶正抗癌方及协同吉非替尼抑制细胞增殖的分子机制。方法:1.采用transwell小室和划痕实验检测扶正抗癌方对A549、PC9、H1650细胞侵袭和迁移能力的影响,采用蛋白质印迹法检测扶正抗癌方对A549、PC9、H1650细胞上皮间质转化相关蛋白,如间质细胞的标志蛋白波形蛋白(Vimentin)和神经钙黏素(N-Cadherin)的影响,检测扶正抗癌方对A549、PC9、H1650细胞转移相关通路的信号转导子与转录激活子 3(signal transducers and actibators of transcription 3,STAT3)的表达,采用蛋白质印迹法和MMP-9活力检测试剂盒双重检测扶正抗癌方对 A549、PC9、H1650 细胞基质金属蛋白酶家族-9(matrixmetalloprotein-9,MMP-9)蛋白质和活力的影响,采用瞬时转染的方法过表达STAT3后,观察扶正抗癌方在A549、PC9、H1650细胞中对MMP-9活力的影响。2.采用MTS法检测扶正抗癌方对吉非替尼原发和继发耐药细胞A549、H1650增殖活力的影响及扶正抗癌方联合吉非替尼对A549、H1650增殖活力的影响,采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测扶正抗癌方对A549、H1650细胞凋亡的影响,采用蛋白质印迹法检测扶正抗癌方对A549、H1650细胞增殖相关通路Akt(又名蛋白激酶B,PKB)时间依赖性磷酸化蛋白的影响,浓度依赖性检测扶正抗癌方对 A549、H1650 细胞核转录因子 NF-κB(nuclear factor-κ-gene binding)成员p50和p65蛋白及增殖相关蛋白黏蛋白1(mucinl,MUC1)的影响,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测扶正抗癌方对A549、H1650细胞MUC1mRNA的表达水平;采用双荧光素酶报告基因检测扶正抗癌方对A549、H1650细胞MUC1启动子活性的影响;采用瞬时转染技术分别过表达Akt、p65、MUC1后,检测扶正抗癌方对A549、H1650细胞中其他蛋白及细胞增殖活力的影响,以此来确定信号间的上下游关系;采用蛋白质印迹法检测扶正抗癌方联合吉非替尼对A549、H1650细胞中Akt、p65、MUC1等蛋白的影响,明确两者协同效应的作用机制。3.建立裸鼠皮下移植瘤模型,分别设立对照组、扶正抗癌方组、吉非替尼组、扶正抗癌和吉非替尼联合给药组四组,测量各组肿瘤的体积、重量,称量裸鼠的体重变化,并通过小鼠活体成像技术观察不同组别的荧光强度等;通过蛋白质印迹法观察裸鼠移植瘤组织中p-Akt、p65、MUC1等蛋白的变化。结果:1.分别给予浓度为0、1、2 mg/mL的扶正抗癌方药液处理后,与对照组相比,穿过transwell小室的细胞数量明显减少(P<0.05);用200 μL枪头对细胞行划痕处理,分别继续培养12h和24h后,与对照组相比,给药组划痕宽度更宽(P<0.05)。2.给予浓度为1,1.5,2 mg/mL扶正抗癌方药液处理后,western blot检测发现,与对照组相比,Vimentin、N-Cadherin和MMP-9表达下调,且随着给药浓度的增大,下调作用逐渐增强(P<0.05);MMP-9活力检测发现,与对照组相比,给药组MMP-9活力下降,且随着给药浓度的增大,抑制作用逐渐增强(P<0.05);给予浓度为2 mg/mL的扶正抗癌方药液处理后,在0.5,2,4,8,24 h时间点处,与对照组相比,给药组p-STAT3(Tyr705)表达逐渐下调(P<0.05);过表达STAT3后加药组与单独加药组相比,MMP-9活力上调(P<0.05)。3.给予浓度分别为0.5,1,1.5,2,2.5,3 mg/mL的扶正抗癌方药液处理后,分别于24,48,72 h后测定各组细胞活力,与对照组相比,给药组在各时间点处的细胞活力明显降低(P<0.05);相同时间点处,随着给药浓度的增大,细胞活力逐渐降低(P<0.05);相同给药浓度,随着时间的延长,细胞活力亦逐渐降低(P<0.05);给予浓度分别为0.5,1,1.5 mg/mL的扶正抗癌方药液处理,24 h后检测发现,随给药浓度的增加,细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例逐渐增加,而正常细胞的比例逐渐减少(P<0.05)。4.给予浓度为2 mg/mL的扶正抗癌方药液处理,0.5,2,4,8,24 h后,给药组p-Akt(Ser473)蛋白的表达相比对照组均下调(P<0.05);给予浓度分别为0.5,1,1.5,2,2.5 mg/mL的扶正抗癌方药液处理,24 h后检测发现,与对照组相比,给药组MUC1和p65表达均下调,且随给药浓度的增大,下调作用逐渐增强(P<0.05);给予浓度为2 mg/mL的扶正抗癌方药液处理后,检测发现MUC1 mRNA和MUC1 promotor表达比对照组下调(P<0.05);过表达Akt后加药组与单独加药组相比,p65表达上调(P<0.05);过表达Akt后加药组与单独加药组相比,MUC1表达上调(P<0.05);过表达MUC1后加药组与单独加药组相比,p65表达基本不变(P>0.05);过表达MUC1后加药组与单独加药组相比,p-Akt(Ser473)表达上调(P<0.05);过表达MUC1后加药组与单独加药组相比,细胞活力增强(P<0.05)。5.扶正抗癌方与吉非替尼联合给药组与吉非替尼单独给药组相比,细胞活力下降(P<0.05),p-Akt(Ser473)蛋白表达下调(P<0.05),p65 蛋白表达下调(P<0.05),MUC1蛋白表达下调(P<0.05)。6.体内实验发现,吉非替尼单独给药组与对照组相比,移植瘤的重量、体积和荧光强度差异不明显(P>0.05),扶正抗癌方单独给药组与对照组相比,移植瘤的重量更轻、体积更小、荧光强度更弱(P<0.05),联合给药组与吉非替尼单独给药组相比,移植瘤的重量更轻、体积更小、荧光强度更弱(P<0.05);western blot检测发现,扶正抗癌方单独给药组与对照组相比,p-Akt(Ser473)、p65和MUC1的表达均下调(P<0.05),联合给药组与吉非替尼单独给药组相比,p-Akt(Ser473)、p65和MUC1的表达均下调(P<0.05)。结论:1.扶正抗癌方以浓度依赖性抑制A549、PC9、H1650细胞的侵袭和迁移;以浓度依赖性下调间质细胞代表物Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达,逆转上皮细胞向间质细胞的转化,从而抑制非小细胞肺癌的转移;以浓度依赖性下调MMP-9蛋白的表达及MMP-9活力,以时间依赖性下调p-STAT3(Tyr705)蛋白的表达,且过表达STAT3能逆转扶正抗癌方对MMP-9活力的下调,表明扶正抗癌方可通过抑制STAT3-MMP9通路抑制非小细胞肺癌的转移。2.扶正抗癌方以浓度和时间依赖性抑制A549细胞和H1650细胞的增殖;以浓度依赖性促进A549细胞和H1650细胞的凋亡;以时间依赖性下调p-Akt(Ser473)蛋白的表达,以浓度依赖性下调MUC1蛋白和p65蛋白的表达,过表达Akt可以逆转扶正抗癌方对p65的抑制,过表达p65可以逆转扶正抗癌方对MUC1蛋白的抑制,而过表达MUC1蛋白并不能逆转扶正抗癌方对p65的抑制,因此考虑p65在MUC1的上游,最后我们过表达MUC1逆转扶正抗癌方对p-Akt(Ser473)的抑制,进一步证明我们的假设是成立的,当过表达MUC1时,逆转了扶正抗癌方对增殖的抑制。表明扶正抗癌方通过Akt-p65-MUC1通路抑制非小细胞肺癌的增殖。3.扶正抗癌方协同吉非替尼对细胞增殖的抑制效应优于吉非替尼单药,其作用机制亦是通过抑制Akt-p65-MUC1通路来实现的。4.体内实验进一步证实了扶正抗癌方以及协同吉非替尼可通过Akt-p65-MUC1通路抑制非小细胞肺癌的增殖。