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乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可引起慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌等后果,全球每年约100万人死于HBV引起的肝脏类疾病,目前尚无有效的治愈手段,严重威胁着全球公共健康。HBV感染引起肝癌的过程十分复杂,目前公认的HBV致癌机制主要包括:乙肝表面抗原（HBs Ag）持续存在引发的慢性炎症、乙肝病毒X蛋白（HBx）作为原癌基因激活剂激活宿主细胞原癌基因表达、乙肝病毒DNA（HBV DNA）整合至宿主细胞基因组进而引起染色体不稳定等。近年来,包括本课题组在内的研究人员通过对宿主细胞DNA修复机制的研究发现,HBV感染后宿主细胞DNA修复系统出现异常,可能与后续发生的基因组突变积累、病毒基因组整合、染色体不稳定以及肝癌的发生有关。为进一步探究HBV感染对宿主细胞DNA修复系统的影响,我们以HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64、Hep G2.2.15以及其背景细胞系Hep G2为研究对象,利用RNA-seq测序技术对HBV稳定转染前后宿主细胞的转录组进行了分析,结果显示HBV稳定转染后宿主细胞在转录组水平出现了大量差异表达的基因,利用RT-q PCR和Western Blot技术进一步检测,我们发现HBV稳定转染细胞系中DNA同源重组修复相关基因RAD52在m RNA和蛋白水平的表达量均出现了显著下调。随后,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和重组荧光素酶表达载体构建了用于检测细胞DNA同源重组修复能力的CRISPR-SSA报告系统,并利用该系统证实了HBV稳定转染后宿主细胞DNA同源重组修复能力出现显著下降。最后,为了验证RAD52基因在宿主细胞DNA修复中发挥的作用,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向突变了HEK 293T细胞中的RAD52基因,结果显示RAD52基因突变后的HEK 293T细胞系中多个DNA修复相关基因出现表达下调,且宿主细胞DNA同源重组修复能力出现显著下降,提示RAD52基因或在HBV感染所致的DNA修复抑制中发挥了关键作用。1.HBV稳定转染前后对宿主细胞转录组分析为了探究HBV稳定转染前后宿主细胞转录组水平的改变,我们利用RNA-seq测序技术对HBV稳定转染前后的细胞Hep G2、Hep G2.A64、Hep G2.2.15进行了测序分析。结果显示,与Hep G2细胞相比,HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64中共有613个基因出现差异表达,另一HBV稳定转染细胞系Hep G2.2.15中共有6085个基因出现差异表达。通过Reactome富集分析发现,这些差异表达的基因富集至细胞各类代谢通路中,值得注意的是,部分表达下调的基因富集在了DNA双链断裂、DNA修复相关通路。利用RT-q PCR方法,我们对DNA修复通路中重点基因进行了验证。结果显示,与Hep G2细胞相比,HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64和Hep G2.2.15中的RAD51、ERCC2、PARP1、ATM、DDB1、RPA1等DNA修复相关基因表达量降低,其中RAD52和XRCC2基因的表达量在Hep G2.A64和Hep G2.2.15两个细胞系中均显著降低（在Hep G2.A64和Hep G2.2.15中RAD52表达量分别下降68.96%±7.59%和60.63%±5.04%,XRCC2表达量分别下降69.58%±6.32%和58.87%±9.34%）。利用Western blot方法,我们对DNA修复通路中重点基因进行蛋白表达水平的验证,结果显示,与Hep G2细胞相比,HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64和Hep G2.2.15中的RAD52表达量分别下降69.93%±3.88%和85.74%±2.1%。上述结果表明HBV稳定转染细胞系中大量基因出现差异表达,同时,DNA同源重组相关基因RAD52的表达出现显著下调。2.HBV稳定转染前后宿主细胞DNA同源重组修复能力的评价为了进一步探究HBV稳定转染细胞系中DNA同源重组修复能力的变化,我们利用CRISPR/Cas9系统和重组荧光素酶表达载体,自主建立了一套用于检测细胞DNA同源重组修复能力的CRISPR-SSA报告系统。该系统通过在表达荧光素酶的p GL3质粒中引入一段带有同源臂的插入序列,使得正常情况下荧光素酶无法表达,利用靶向插入序列的CRISPR/Cas9系统切割上述荧光素酶重组质粒,荧光素酶重组质粒借助宿主细胞DNA同源重组系统进行修复后表达荧光素酶使得荧光素酶底物发光,并以此反映宿主细胞DNA同源重组修复能力。利用CRISPR-SSA报告系统,我们分别检测了HBV稳定转染前后细胞系Hep G2、Hep G2.A64、Hep G2.2.15的同源重组修复能力,结果显示,在CRISPR-SSA报告系统转染后48小时,Hep G2.A64细胞的同源重组修复能力仅为Hep G2细胞的10.96%±0.39%,Hep G2.2.15细胞的同源重组修复能力仅为Hep G2细胞的28.44%±1.82%,结果表明HBV稳定转染细胞系中DNA同源重组修复能力出现了显著降低。3.RAD52基因与宿主细胞DNA修复系统关系的研究为了深入探究RAD52基因在宿主细胞DNA同源重组修复中的作用以及其与其他DNA修复基因的关系,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在HEK 293T细胞系的基础上构建了RAD52基因突变细胞株,该细胞株中RAD52表达量相比野生HEK 293T细胞株下降了97.98%±1.19%。随后,我们利用CRISPR-SSA报告系统评估了RAD52抑制前后HEK 293T细胞中DNA同源重组修复能力。结果显示,相比野生HEK 293T细胞株,RAD52基因抑制后的细胞株中DNA同源重组修复能力下降了31.18%±2.5%。同时,我们利用RT-q PCR技术检测了RAD52基因抑制后的细胞株中其他DNA修复相关基因。结果显示,相比野生HEK 293T细胞株,RAD52基因抑制后的细胞株中ERCC2表达量下降49.07%±0.49%,XRCC2表达量下降49.35%±0.08%,DDB1表达量下降43.93%±3.57%。结果提示RAD52基因的表达下调可引起宿主细胞DNA同源重组修复能力显著下降,同时可抑制宿主细胞DNA修复相关其他基因的表达,该基因可能在宿主细胞DNA修复过程中发挥了关键作用。综上,本研究发现了HBV稳定转染后的细胞系中大量基因出现差异表达,DNA修复相关基因RAD52基因出现表达下调,同时HBV稳定转染细胞系中的DNA同源重组修复能力受到显著抑制。随后,通过实验证实了宿主细胞内RAD52基因的表达下调可引起DNA同源重组修复能力显著下降,同时可抑制宿主细胞DNA修复相关其他基因的表达。上述结果提示,HBV可能通过下调同源重组修复通路中的RAD52基因抑制宿主细胞DNA同源重组修复能力,进而导致宿主基因因无法正常修复发生大量差异表达。本研究探索了HBV与宿主细胞DNA同源重组修复系统的关系,为后续探究HBV与宿主细胞基因组相互作用以及致癌机制提供新的思路。