论文部分内容阅读
重组人生长激素（rhGH）在临床有着十分广阔的应用前景，在肯定rhGH疗效的同时，出现的抗体形成、胰岛素耐受、甲状腺机能减退、价格昂贵、长期注射不便等问题也引起了人们的关注[1]。因此，研究人员积极寻找更简便、更有效的能够促进垂体生长激素分泌的药物。1982年，研究人员在脑啡肽类似物结构的基础上合成了第一个对生长激素分泌有刺激效应的非天然生物活性肽，此肽由6个氨基酸组成，其中包含两种D型氨基酸，称为生长激素释放肽-6（Growth hormone releasing peptide-6，GHRP-6）[2]。随后几年，研究组又在GHRP-6的基础上合成了七肽的GHRP-1和六肽的GHRP-2，这两种活性肽刺激生长激素分泌的作用较GHRP-6更强[3-4]。这几种GHRP除了有较强的促进生长激素释放的作用外，GHRP对心血管功能、摄食、脂肪细胞分化、胃酸分泌和胃肠运动的调节等作用也引起了人们注意，尤其是GHRP对心脏功能多方面的调节和改善作用成为近年来研究的热点[5]。GHRP没有物种专一性，在动物体内具有促进生长激素释放、刺激动物食欲、促进动物生长、影响动物生产性能和提高动物免疫水平等多方面的功能，GHRP的研究发展对畜牧业生产也具有十分重要的意义[6]。目前，国内外对GHRP的作用机制、生理作用等进行了大量的理论和实践研究，国内在上世纪90年代已有Boc固相合成策略合成GHRP-6的报道[7]。近来研究多集中在GHRP药理研究上，在此基础上，探索GHRP的合成方法，优化合成工艺，降低合成成本，成为越来越重要的课题。GHRP通过大量的结构改造而来，含有多种芳香族氨基酸，其序列中的D型氨基酸能够有效地抑制蛋白酶的识别和水解，使其各种给药途径的利用率比其他肽类药物都高，对维持多肽的生物活性起着重要作用[8]。本课题采用Fmoc固相合成策略，以RinkAmide-AM树脂为载体，选择碳二亚胺型缩合试剂DIC，在活化中添加HOBt试剂减少消旋副反应，逐步缩合完成接肽反应，通过几种不同的切割试剂将粗肽从树脂上切割下来，比较其切割效果。粗肽经半制备高效液相色谱仪分离纯化，再冷冻干燥得到最终产物。得到的纯肽用RP-HPLC进行纯度分析，ESI-MS进行结构分析鉴定。目的：采用Fmoc固相多肽合成方法合成GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2三条短肽，探索影响产物结果的合成条件、切割条件和纯化方法；确立产物的检测方法；降低合成成本，得到纯度较高的目标产物。方法：1GHRP的固相合成以Fmoc固相合成方法分别合成GHRP-6、GHRP-1与GHRP-2。以合适的树脂为载体，选择能够产生较低消旋率的缩合试剂，控制投料摩尔比和反应时间，规范操作，减少接肽反应过程中产生的副产物；通过茚三酮检测反应的颜色变化判断接肽过程中氨基酸的连接程度；探索树脂替代度对合成反应的影响。2GHRP的切割、纯化根据氨基酸不同的保护集团，选择不同的切割试剂配方，进行平行实验；优化切割条件，选择简便、副反应较少的切割方法；切割下来多肽经过冰乙醚沉淀，离心收集产物得到粗肽；采用半制备型RP-HPLC分离纯化；简单处理纯化后产物后经冷冻干燥得到最终产品。3GHRP的结构分析鉴定通过RP-HPLC对合成的GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2的保留时间进行定位、纯度分析，对不同切割试剂的切割效果的HPLC图谱进行比较，对纯化前和纯化后的多肽HPLC图谱进行比较；用ESI-MS分析确证分子量。结果：1GHRP为肽酰胺的结构，选择Rink Amide-AM树脂为载体；缩合体系选择DIC/HOBt，价格低廉，且两者配合使用能有效的降低消旋率，可以将副反应控制在很低的范围内；反应投料摩尔比在1:4时能够反应充分；反应时间一般150min，在连接Phe，His等这些易发生消旋副反应的氨基酸时，避免高温反应环境，缩短反应时间在120min左右；替代度在0.45mmol/g时合成效果较好。2GHRP-6的3种切割试剂脱除保护基效果相似，所得产物纯度也较相近，其中切割溶液TFA：间甲酚（V/V99:1）的配比是最简便的，成本也最小。GHRP-1、GHRP-2所用两种切割试剂也能起到很好的效果。切割实验进行时，反应液先在冰浴中反应0.5h，再30℃反应1h的裂解条件得到的产物副产物少，得率较高。3合成的六肽的GHRP-6、GHRP-2和七肽的GHRP-1经RP-HPLC检测、ESI-MS确定分子量，合成正确；GHRP-6和GHRP-2经半制备RP-HPLC分离纯化后纯度大于95%，GHRP-1的纯度大于85%。结论：本课题采用Fmoc固相多肽合成方法合成了六个氨基酸组成的短肽GHRP-6、GHRP-2和七个氨基酸组成的短肽GHRP-1，三条肽中均含有D型非天然氨基酸；在合成中通过选择消旋率小的缩合试剂，控制反应时间来减少副反应；比较了几种不同的切割试剂对肽树脂的切割效果，优化了切割条件；半制备RP-HPLC分离、纯化得到目标产品纯度能够达到95%以上；所得产物经RP-HPLC确定保留时间，由ESI-MS确证分子离子峰，均与理论分子量相符合。本研究合成工艺操作简单，合成成本较低，能够达到较高的纯度要求，可为其他单位合成此类产品提供借鉴经验。