大肠杆菌是致病类型最多,研究最为广泛的模式菌之一。根据其基因组特点和携带毒力基因的不同,大肠杆菌可以分为共生菌、肠道致病性大肠杆菌和肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC)。ExPEC根据宿主和所涉组织器官的不同可以进一步分为尿道致病性大肠杆菌(UPEC)、脑膜炎型大肠杆菌(NMEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)等。该类大肠杆菌常引起脑膜炎、膀胱感染、肺炎、肾盂肾炎和败血症等。目前,大多数研究聚焦于禽源和人源肠外致病性大肠杆菌,而猪源ExPEC的报道相对较少,重要性缺乏认识。这主要是由于猪源与人源ExPEC祖系群存在一定差异,猪肉中分离的ExPEC数目也低于从禽肉中分离的ExPEC。然而,我们前期调查研究发现我国猪源ExPEC的发病率逐年升高,许多猪源ExPEC与人源ExPEC遗传背景和血清型相同。这些猪源ExPEC的流行病学特征、致病基因类型和致病机制仍然不清。因此,本研究对2006年-2007年间我国10个省的猪源ExPEC流行病学状况进行调查,对新发现的ST1687型脑膜炎型猪源ExPEC代表性菌株(PCN033)基因组特征进行分析,在此基础上选择潜在毒力相关调控基因(ydiv),研究其在猪源ExPEC致病中的作用与机制。这些研究可为后续该病的预防和治疗奠定基础。1.猪源ExPEC流行病学状况调查本研究对2006年至2007年间收集的81株已鉴定的猪源ExPEC样品,分别采免疫凝集和PCR法进行血清分群、祖系分群、多位点序列分型(MLST)和毒力基因分析。结果表明猪源ExPEC优势血清型为O11、O8、O138、O161和O101。81株猪源ExPEC在A、B1、B2和D四个祖系分群中均匀分布,而大部分禽源和人源ExPEC菌株主要来源于B2和D群。多位点序列分型结果表明,收集的猪源ExPEC主要由CC10、CC1687、CC88和CC58四个主要的克隆复合体组成。其中,CC1687的菌株均由我们新发现的序列型细菌组成。该类细菌大部分存在K1荚膜且部分菌株可从大脑和脑积液中分离,与人源脑膜炎型ExPEC类似,但缺乏人源脑膜炎型ExPEC中重要毒力因子,例如ibeA基因,表明CC1687可能具有其特殊的毒力基因组成。CC1687来源的菌株在我国不同的省份被分离到,说明该菌株已在多个省份流行。CC10复合体的部分ST型菌株在人源ExPEC中也有报道,说明猪源ExPEC也具有成为人畜共患病的潜在可能。2.不同宿主ExPEC的比较基因组学分析因不同宿主ExPEC菌株具有不同的毒力基因类型,猪源ExPEC可能与人源和其他动物源(牛源和禽源)ExPEC存在不同的毒力基因和致病机制。本课题组基于猪源ExPEC流行病学的调查结果,选取了我们新发现CC1687克隆复合体中致脑膜炎型强毒菌株(PCN033)测序,比较分析不同物种来源ExPEC,包括猪源(PCN033)、牛源(LS4)、禽源(APEC O1)和人源(CFT073和RS218)ExPEC的基因组差异,寻找猪源ExPEC宿主特异性和共性的毒力基因。通过对全基因组同源蛋白的Blast比较,我们发现脑膜炎型猪源ExPEC PCN033与其它宿主来源ExPEC比具有692个独特基因。COG分析表明这692个猪源ExPEC PCN033特有基因与有机物代谢分解相关,可能与其它菌株相比能够利用更多的有机物,这有助于其对不同环境的适应。对差异基因在基因组的位置分析,我们发现PCN033存在15个特有的基因岛,其中sGI1、sGI11和sGI13存在假定的六型和三型分泌系统,是潜在的毒力因子;猪源ExPEC在鞭毛系统、粘附因子和毒力基因上与其它宿主来源ExPEC存在一定差异,且人源脑膜炎型ExPEC重要毒力因子ibeA在猪源ExPEC中缺失。因此,猪源脑膜炎型ExPEC PCN033可能存在特殊的毒力因子或机制。这些毒力因子作用的调查可为脑膜炎型猪源ExPEC致病机制的研究奠定基础。3.猪源ExPEC鞭毛调控基因ydiv调控机制和功能研究在前期基因组分析的基础上,本课题组构建转录调控因子的突变株,并利用小鼠模型评估调控因子缺失菌株对毒力的影响。结果发现猪源脑膜炎型ExPEC PCN033缺失c-di-GMP结构域的假定调控蛋白Ydiv后,毒力显著下降,说明Ydiv在ExPEC PCN033毒力调控中的重要作用。我们通过RNA-seq法比较该缺失菌株和野生菌株转录组水平的变化,发现ydiv基因可以影响12个基因的表达,其中大部分基因与鞭毛相关。运动性试验也证实ydiv基因可以影响PCN033细菌的运动能力。在对ydiv调控机制的研究中,我们通过细菌双杂交试验,发现Ydiv可以与鞭毛调控蛋白FlhD发生蛋白-蛋白相互作用;表面等离子共振试验发现Ydiv蛋白可以与鞭毛调控基因flhDC和ydiv自身的启动子发生结合。在对ydiv功能研究中,我们发现?ydiv突变株在体外实验中对脑微血管内皮细胞的粘附能力增强,且这种粘附能力增强依赖于突变株导致的鞭毛表达上调,而无鞭毛的双突变菌株?ydiv?fliA对血管内皮细胞粘附能力回复。在体内试验中,?ydiv突变株对大脑粘附能力不变,而对其它组织的粘附能力显著下降。上述研究表明鞭毛是猪源ExPEC PCN033对脑微血管内皮细胞的粘附因子。感染清除试验表明ydiv突变株组织载菌量的下降是由于突变菌株鞭毛的大量表达导致其与野生菌株比更容易被宿主清除,推测鞭毛的表达可以促进免疫吞噬细胞的识别和清除。巨噬细胞吞噬试验结果与我们推测相符合,即?ydiv菌株被巨噬细胞吞噬率高于野生菌株,而?ydiv?fliA菌株被巨噬细胞吞噬率低于野生菌株,表明鞭毛可以介导免疫吞噬细胞对ExPEC的识别和吞噬。这些研究表明鞭毛是猪源ExPEC对血管内皮细胞的重要粘附因子,Ydiv一方面可以通过蛋白-蛋白作用和蛋白-DNA作用的双重机制抑制鞭毛基因的表达,减少ExPEC被免疫吞噬细胞识别和清除,促进ExPEC在宿主体内存活,另一方面Ydiv通过自身负反馈调节避免对鞭毛的过度抑制,保留其对脑组织的粘附和侵入能力。