论文部分内容阅读
1.太平洋牡蛎EST-SSR标记分离及特性分析太平洋牡蛎自上世纪80年代从日本引进至今,已为贝类养殖业创造出极为可观的经济效益,为保证牡蛎种质质量和牡蛎养殖业可持续发展,依靠分子生物学和生物信息学手段,从太平洋牡蛎的ESTs数据库查找了23,816条EST序列,进行聚类分析来筛选微卫星序列,分离得到了68个EST-SSR标记,采用群体多态性分析结果显示,位点的等位基因数平均值为4.9,观测杂合度和期望杂合度分别为从0.0333到0.9667,和从0.0655到0.9149。经Bonferroni校正后,22个位点仍偏离哈迪温伯格平衡,4个位点出现连锁不平衡。经基因型判定,32个位点在全同胞家系呈现分离,其中11个位点出现偏分离。通用性检测结果显示,在C. angulata中40个位点成功扩增,C. ariakensis中有45个位点成功扩增。这68个EST-SSR标记的开发,为家系鉴定、遗传多样性检测、遗传图谱的构建和系统发育分析等工作提供更丰富的遗传标记信息。2.太平洋牡蛎SNP标记的分离及特性分析SNP作为第三代分子标记在牡蛎中的开发起步较晚,本研究首次利用四引物ARMS-PCR方法,分离20个太平洋牡蛎SNP标记,并采用威海野生群体和连云港养殖群体进行遗传多样性评价。最小等位基因频率威海群体从0.033到0.467,连云港群体从0.033到0.367。在威海群体观测杂合度与期望杂合度范围分别从0.067到0.800和从0.064到0.500,连云港群体观测杂合度和期望杂合度分别从0.067到0.733和从0.064到0.464。两个位点显著偏离哈迪温伯格平衡(P<0.05/20),未见有位点间连锁不平衡存在。太平洋牡蛎SNP标记的开发,是绘制SNP图谱,进行性状改良和遗传疾病诊断分析的基础和依据。3.太平洋牡蛎EPIC标记的分离及特性分析本章利用太平洋牡蛎的功能基因和EST序列,开发了12个EPIC-PCR位点。选用连云港养殖群体进行遗传多样性检测,结果显示平均等位基因数为7.3,观测杂合度和期望杂合度范围分别为从0.067到0.633、从0.098到0.853。6个位点经校正之后显著偏离哈迪温伯格平衡(P<0.05/12)。随机选取两个位点Cglns和CgEF进行内含子多态性形成的序列分析,证实内含子多态性是由随机插入和缺失引起。采用一个全同胞家系进行遗传特性分析,除CgFMO在家系中为纯合子外,其余11个位点经X2检验均符合孟德尔遗传(P>0.019)。选葡萄牙牡蛎、近江牡蛎、香港巨牡蛎和熊本牡蛎进行检测,9个位点得到成功扩增,说明了EPIC良好的种间通用性。由此可见,EPIC作为一种新型遗传标记具备极大的应用潜力。4.不同类型标记在太平洋牡蛎群体遗传学研究中的比较分析利用gSSR、EST-SS和SNP三种标记,通过对六个太平洋牡蛎群体的遗传学研究,来对这3种标记系统进行比较分析。遗传多样性gSSR标记平均观测杂合度0.612,平均期望杂合度0.852；EST-SSR标记平均观测杂合度0.630,平均期望杂合度0.763；SNP标记平均观测杂合度0.483,平均期望杂合度0.452。三种标记分析得出的遗传分化结果以及NJ树的分枝结构都表现出相关性。EMI值gSSR为0.6544,EST-SSR为0.5265,SNP为0.4482。gSSR由于PIC值高,是家系分析、种群遗传分析的良好标记；EST-SSR由于较gSSR序列保守,更适用于系统发育分析；SNP适合高密度图谱的构建。本研究得出这三种分子标记系统在牡蛎遗传学研究分别的适用领域,为在进行不同研究时选择适合的分子标记系统提供参考。5.基于EST-SSR标记的牡蛎系统发生研究利用第二章开发的10个EST-SSR标记,对熊本牡蛎、岩牡蛎、葡萄牙牡蛎、有明巨牡蛎、香港巨牡蛎和太平洋牡蛎进行系统发育分析。平均等位基因数依次是4.1、3.5、4.3、4.0、4.3和5.0,21.6%的位点观测杂合度高于期望杂合度。Cgl54, CgL40两位点在所有种群中符合哈迪温伯格平衡,其它8个位点,经过Bonferroni校正后,仍然在不同种中出现显著偏离。UPMGA树和NJ树结果均显示,有明巨牡蛎与香港巨牡蛎、熊本牡蛎与岩牡蛎分别存在较近的亲缘关系,太平洋牡蛎的节点线段最长。本研究初步探讨不同地理分布的牡蛎种系统发生关系。