生物冶金技术在处理低品位、难开采矿石方面具有强大优势,能从废矿石、矿渣中有效浸出金属,与传统冶金工艺相比具有成本低、耗能少、环境污染小的优点。为了提高我国矿产资源的有效利用率,必须构建高效浸矿菌株,深入开展生物冶金技术的研究和应用。生物浸矿过程中铜离子的不断溶出积累,对冶金微生物产生毒害,导致生物冶金的效率降低,因此,构建稳定遗传的高抗铜基因工程菌是提高生物冶金效率的有效手段。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans,简称A.ferrooxidans）是生物浸矿中的优势菌种,据报道该菌可以耐受高浓度的铜离子,是研究浸矿细菌铜抗性的好材料,但是,该菌在铜离子抗性方面的研究还不完善,仅有利用生物信息学,蛋白组学以及转录组学研究参照大肠杆菌推测的铜抗性模型,因此,深入研究模型中的铜抗性基因,不仅可以丰富完善该菌的铜抗性机制,还可为构建高效抗铜菌株提供理论依据和实验数据。在嗜酸性氧化亚铁硫杆菌铜抗性机制模型中有Cop系统、Cus系统、polyP系统以及一些铜离子转运蛋白是该菌可以耐受很高铜离子的关键。其中Cop系统由三个预测的与铜离子转运相关的P-ATPase组成,其编码基因分别是AFE₂779（copA1）、AFE₂439（copA2）、AFE₂021（copB）。有一些文献中已经报道将copA1和copB基因分别在大肠杆菌铜抗性缺陷株中异源表达,可提高缺陷株的铜抗性,但是CopA1和CopB在极端嗜酸性A.ferrooxidans铜抗性中的功能尚不确定。分析本实验室关于A.ferrooxidans铜抗性的转录组数据,也发现在铜离子刺激下copA1、copB上调比较高,因此,本文选取A.ferrooxidans铜抗性Cop系统中的copA1和copB进行研究,探究CopAl和CopB在极端嗜酸性A.ferrooxidans铜抗性中的作用。基因敲除是基因功能研究的有效手段,为了研究copA1和copB这两个基因在嗜酸性氧化亚铁硫杆菌在铜抗性方面的作用,本文采用本实验室建立的无标记基因敲除方法对这两个基因分别进行了敲除。首先根据NCBI上d.ferrooxidans ATCC 23270基因组上两基因的序列分别设计了引物,扩增了基因的上游同源臂和下游同源臂,分别连接到pUC19质粒上进行测序;并将测序正确的序列亚克隆到敲除质粒pK19上,构建了两基因的敲除质粒pK19-copA1和pK19-copB。然后,分别将两个敲除质粒采用接合转移的方法转到宿主菌A.ferrooxians ATCC 23270中,利用卡那霉素抗性筛选获得敲除质粒整合至A.ferrooxidan 基因组上的单交换子;进一步将含有酵母限制性内切酶编码基因的重组质粒pMSD1-I-Scel导入单交换子中,诱导单交换子发生第二次同源重组,通过筛选成功获得copA1、copB基因分别敲除的突变株A.ferrooxidans ΔcopA1和A1和A.ferrooxidans ΔcopB,为研究copA1和copB基因在该菌铜抗性中的功能提供了实验材料。在成功构建A.ferrooxidans ΔcopA1和A.ferrooxidans △copB两个基因敲除突变株的基础上,以A.ferrooxidans ATCC 23270野生型为对照,分别测定了敲除突变株以硫粉为能源时的生长曲线和以亚铁为能源时的亚铁氧化曲线,结果显示copA1、copB这两个基因的单独敲除仅在一定程度上降低了该菌的抗铜性质,并没有使A.ferrooxidans完全丧失抵抗铜离子的性质。又采用RT-qPCR方法分析了突变株中与铜抗性相关基因的差异性表达,结果显示在以亚铁为能源时比以硫粉为能源时显示差异表达的基因多,在两个敲除菌中都上调的基因有copC、copZ和ompA,都显著下调的基因是omp40,只在copA基因敲除后ppK1、ppK2和cusA也有明显的上调。以上结果说明A.ferrooxidans菌株的抗铜特性由多个抗铜系统同时发挥作用,一个抗铜系统受损可通过增强其他抗铜系统弥补。综上,本文通过构建A.ferrooxidans ΔcopA1和ΔcopB基因敲除突变株、测定敲除突变株的抗铜性质及分析铜抗性基因的差异表达,发现在A.ferrooxidans铜抗性机制中,Cop系统、Cus系统、polyP系统以及omp40、tonB和ompA编码的外膜蛋白都发挥一定的作用,Cop抗铜系统受损可通过增强其他抗铜系统弥补,由于没有同时敲除Cop系统所有基因,尚需进一步研究才能评价Cop系统在该菌铜抗性中的地位。本文构建的copA1和copB基因敲除突变株为研究这两个基因在A.ferrooxidans铜抗性中的作用提供了直接的实验材料。