新型溶栓药的研制正成为人们研究的热点，作为新来源的第三代溶栓药蚯蚓纤溶酶也倍受关注。蚯蚓也称“地龙”，在中国传统中医中用来治疗高热神错、惊痫抽搐、关节痹痛、肢全麻木、半身不遂、肺热咳喘、尿少水肿及高血压等症。蚯蚓纤溶酶(Earthworm Fibrinolytic Enzyme，EFE)是近年来在蚯蚓体内发现的一类多蛋白质组分的丝氨酸蛋白酶。EFE既具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有类尿激酶的纤溶酶原激活活性(因此EFE又被称为Lumbrokinase)，具有良好的开发前景。 本室经亲和层析自蚯蚓匀浆液一步提取蚯蚓纤溶酶，并通过DEAE纤维素离子交换层析和制备电泳，将EFE进一步分离纯化得到了12个单一组分，随后根据蚯蚓纤溶酶最佳组分7的N末端氨基酸序列设计简并引物，以蚯蚓cDNA为模板，获得该组分蛋白质的部分编码序列，将该序列分别插入热启动诱导的pBV221和融合型的pTBYT11质粒，转化大肠杆菌进行表达，产物均以包含体形式存在。与此同时将上述基因与甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9K重组，利用电击转化法成功实现EFE基因在甲醇酵母中的转化和染色体整合。 本实验在已有工作基础上，通过对电击条件的优化，摸索出LN—101型国产电转仪电转化甲醇酵母的最佳条件(4500V／cm、10μF)，可以得到大量转化子(5×10~3个／μgDNA)。在此基础上，利用原核表达产物通过微量免疫制备了大量特异性很高的抗体，建立了原位双膜法对转化子进行了大量筛选，得到了上百株重组子。通过western botting将本实验表达的EFE与天然EFE各组分进行分析，确定本实验所表达的蛋白为EFE的7组分。同时首次将EFE基因转入携带有外源蛋白HSA基因的重组子，筛选出EFE与HSA共表达的重组菌株。最后，通过正交实验对诱导表达条件做了初步研究。