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目的:探讨模拟高原缺氧大鼠肠上皮细胞自噬变化情况及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路调控自噬的机制,为进一步研究靶向防治高原相关肠道疾病提供新的理论依据。方法:以大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)为体外实验对象,应用三气培养箱模拟高原缺氧(5%O2)构建IEC-6细胞缺氧损伤模型为实验组(Hypoxia),以正常含氧培养箱中的IEC-6细胞作为对照组(Control):(1)MTT法检测常氧条件下不同浓度的3-MA以及缺氧条件加入筛选出浓度的3-MA(3-MA+Hypoxia)对IEC-6细胞6 h、12 h、24 h、48 h各时间点的毒性作用,以及在对IEC-6细胞6 h、12 h、24 h、48 h各时间点的细胞存活率;(2)应用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色法、透射电镜及蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测缺氧处理IEC-6细胞6 h、12 h、24 h、48 h各时间点自噬体和或自噬溶酶体点状荧光颗粒、自噬体双层膜结构及自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达变化;(3)选择缺氧自噬最明显时间点加入自噬抑制剂3-MA后,用荧光显微镜观察MDC染色的自噬体和或自噬溶酶体点状荧光颗粒,透射电镜观察自噬体双层膜结构,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的表达变化。结果:(1)3-MA对IEC-6细胞毒性的MTT结果显示:随着3-MA浓度的增加及作用时间的延长,它对IEC-6细胞增殖的抑制率逐渐增强,呈现时间依赖性和浓度依赖性。当3-MA浓度为≤5mmol/L时,对IEC-6细胞增殖的抑制率及药物毒性较小,选择5mmol/L为3-MA的实验浓度;(2)缺氧对IEC-6细胞增殖的MTT结果:6 h、12 h细胞存活率出现了下降,但差异无统计学意义(P>0.05),处理24 h、48 h后细胞存活率明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在缺氧加入自噬抑制剂3-MA同时培养后,从处理12h开始细胞存活率较单纯缺氧组显著下降,24 h、48 h下降更明显,差异有统计学意义(P<0.05);(3)MDC染色结果显示:常氧组细胞内未见明显自噬体点状荧光颗粒,从缺氧6 h起细胞内开始出现点状荧光颗粒,细胞内点状荧光颗粒大多分部细胞核周围,在24 h时自噬点状荧光颗粒达到顶峰,作用48 h后细胞总数及细胞内点状荧光颗粒开始下降;(4)透射电镜结果显示:缺氧6 h组开始出现双层膜结构的自噬体,随着缺氧时间的延长,双膜自噬体的数量逐渐增加,其中以缺氧24 h组自噬体增多最为明显;缺氧48 h组细胞内仍可见大量自噬体囊泡,但细胞结构破坏,细胞核及细胞膜不程度碎裂;(5)Western blot法结果显示:缺氧6 h、12 h、24 h、48 h组自噬相关蛋白LC3及Beclin-1表达均显著高于常氧组,48 h后表达有所下降,差异有统计学意义(P<0.05);(6)缺氧加入自噬抑制剂3-MA后,透射电镜及MDC染色结果均表明,IEC-6细胞核周围的自噬体较缺氧组显著减少;Western blot法检测结果显示,自噬相关蛋白LC3及Beclin-1表达较单纯缺氧组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);单纯缺氧组细胞p-Akt蛋白表达水平明显高于常氧组,差异有统计学意义(P<0.05),使用自噬抑制剂3-MA后,p-Akt蛋白表达量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);Akt在缺氧IEC-6细胞损伤后无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)模拟高原缺氧IEC-6细胞损伤时可诱导自噬发生;(2)PI3K/Akt信号通路可能对自噬有调节作用。