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目的：建立人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)体外分离、培养及扩增的方法,观察MSCs体外培养增殖的生物学特性,并应用流式细胞术,检测细胞表型,分析鉴定MSCs的纯度。方法：本论文采用的主要研究方法如下：(1)无菌条件下抽取骨髓液5mL,用等体积PBS稀释混匀,室温下1500rpm离心10分钟,弃去脂肪层,将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液(1.077g/mL)上面,室温2500rpm离心30分钟,吸取界面白膜状层的单个核细胞。用PBS混悬后,室温1500rpm离心10分钟,弃上清并重复洗涤2次。用含10%FBS的LG—DMEM培养液重悬细胞,调整细胞密度为2x105/mL,接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。3天后首次换液,弃去悬浮细胞后,每2-3天换液一次。每日镜下观察细胞形态及生长变化,待细胞生长达80%-90%融合时,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA (1:1, V/V)进行消化,再按1：2比例进行传代培养,共传代三次。(2) MSCs的生长曲线测定：取P3细胞,按5×104/mL浓度接种于24孔培养板培养,每天取3孔,计算平均值,连续培养8天,采用血球计数板计数法,绘制生长曲线。(3)贴壁率测定：取P3细胞,按5×104/mL浓度接种于25cm2培养瓶内培养,每2小时取2瓶,消化计数,计算贴壁率,绘制贴壁率曲线。(4) MSCs的表型鉴定：取P3细胞,将细胞消化吹打制成单细胞悬液,1500rpm离心5分钟,弃去上清液,用PBS重复洗涤后,调整细胞浓度为5×106/mL,各取细胞悬液100μL,分别滴加荧光标记抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、 HLA-DR-PE抗体10μL,4℃避光孵育30分钟,PBS洗涤后应用流式细胞仪进行检测,确定MSCs的表面标志物的表达情况。结果：(1) MSCs属于骨髓中的单个核细胞,采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合可以有效分离、纯化人骨髓MSCs。细胞形态观察：细胞初接种入培养瓶时为圆形的单个核细胞,大小不一,与周围的血细胞相互混杂。培养24小时后,细胞开始出现贴壁,48-72小时细胞贴壁逐渐增多,72小时首次换液后,可见少量分散的短梭形及不规则多角形的初始贴壁细胞。第4-8天细胞生长快,呈集落样生长,可见有粗大的突起伸出,细胞形态呈梭形。第10-12天后细胞克隆进一步扩大,呈大的长梭形,培养至第14-16天时贴壁细胞可达80%～90%融合,大量贴壁细胞呈长梭状成纤维细胞样形态并列或呈漩涡状排列。传代细胞刚接种时为圆形,较大,24小时内能完全贴壁,伸展呈梭形,增殖迅速,5-7天细胞融合可达90%。细胞形态均匀,与成纤维细胞形态相似,大部分呈长梭状,排列规则。(2) MSCs的生长曲线分析：细胞生长曲线呈S形,原代细胞生长比传代细胞慢。原代细胞接种后第0-3天为生长潜伏期；第4-12天为对数生长期；此后逐渐减缓,进入平台期。传代细胞培养时第1-2天细胞生长处于潜伏期,第3天开始细胞生长较快,至第6-7天达顶点,后进入平台期。(3)测定贴壁率：传代后的细胞贴壁较快,4小时贴壁细胞超过50%,而12小时左右超过90%的细胞已经贴壁。(4)流式细胞仪检测P3细胞显示：CD29、CD44、CD105的阳性表达率分别为99.82%、99.82%、97.38%,对CD34、HLA-DR的阳性表达率分别为4.94%、1.87%。结论：(1)联合采用密度梯度离心法和贴壁培养法,能获得较高纯度和活性的MSCs,是一种简便可行的方法；(2)通过观察MSCs的细胞形态、生长特征以及细胞表型的表达情况,可对MSCs进行初步鉴定。