论文部分内容阅读
四环素类药物是人医和兽医临床的一线抗感染药物,在保障人类健康和养殖业的健康发展上发挥了重要的作用。随着此类药物的广泛使用,导致细菌对其耐药谱的不断变大和耐药水平升高,其耐药性对人和动物的健康安全构成严重威胁。本研究采用微量肉汤稀释法,参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准,考察了来源于贵州省8个地区规模化养猪场783株猪源大肠杆菌对四环素类药物的耐药水平和多重耐药状况及耐药谱型。结果表明:受检菌株对土霉素、四环素、金霉素、多西环素、米若环素和替加环素的耐药率分别为97.3%、97.6%、96.6%、89.3%、48.0%和34.2%。受检菌对兽医临床常用药物,如土霉素、四环素、金霉素和多西环素等的耐药较为严重,它们的MIC50分别为256、128、64和32 ug/mL;耐药水平最高的是四环素,其有效治疗浓度(MIC90)超过512ug/mL,是临床推荐治疗量的32倍,在贵州省8个地区的耐药率均超过了92%;其次是土霉素,有效治疗浓度MIC90达到512ug/mL,为临床推荐治疗量的16倍,表现为中度耐药,其耐药率在遵义市和六盘水市耐药较高,黔南地区最低;金霉素和多西环素的耐药水平相对较低,但也表现为中度耐药,以黔西南和铜仁等地的耐药率最低;而米若环素和替加环素的耐药水平最低,MIC90分别为32ug/mL和4ug/mL,均为临床用药量的2倍,但中介率(分别为21.5%和18.5%)较高,其中米诺环素在黔南、遵义和毕节等地区耐药率较高,替加环素在铜仁和黔西南耐药率较高;MIC值的分布和交叉耐药率的分析表明,对第一代四环素类抗菌药物的敏感的菌株,对二代和三代药物也敏感,而对三代耐药后,除米诺环素外,对1-2代均表现为耐药。受试菌的多耐药现象较为严重,5重比例较高(45.98%),最低为零重(占0.89%),主要集中在4-6重之间(占85.5%);多重耐药谱型以土霉素-金霉素-多西环素(占92.1%)为主。采用PCR技术检测783株猪源大肠杆菌中tetA、tetB、tetC、tetD、tetM和tetX基因等6种四环素耐药基因携带情况,结果表明,耐药基因的总检出率为99.75%,tetA、tetB、tetC、tetD、tetM和tetX基因检出率分别为92.60%、41.50%、58.75%、58.62%、70.10%和78.80%;耐药菌以携带复合多基因的类型为主,携带四重耐药基因的菌株最多,占到34.2%,其次是3重和5重,分别为21.1%和26.4%,携带单一耐药基因的菌株较少(2.7%),并以携带tetA多见(占1.53%)。耐药表型与耐药基因携带的相关性分析结果表明:大肠杆菌对土霉素、四环素、金霉素和多西环素耐药分别与其tetB和tetM基因的携带呈极显著相关(P<0.01);tetC检出与米诺还素耐药性极显著相关(P<0.01),与替加环素显著相关(P<0.05);tetD检出与米诺还素和替加环素耐药性极显著相关(P<0.01);tetX检出与替加环素耐药性极显著相关(P<0.01)。通过荧光定量PCR技术,分别检测耐药菌在土霉素、金霉素和多西环素的不同浓度诱导下tetB和tetM基因的相对表达量,结果表明:在土霉素、金霉素和多西环素的诱导下,tetB和tetM基因的表达量随着药物升高出现先升高后逐步降低的现象;在1/64 MIC浓度的土霉素、金霉素诱导下此2个基因表达量最高,随后由于药物抑制作用的加大,细菌生命活动逐渐被抑制,耐药基因表达也随之逐渐降低;在多西环素诱导下在1/16MIC值(4ug/mL)tetB基因表达量最高;tetB和tetM基因在没有药物诱导条件时均没有表达。在相同浓度的土霉素、金霉素和多西环素(0.5ug/mL)诱导下,细菌处于1/128MIC时的tetM基因的表达量远大于1/1024MIC的表达量。以上结果说明:tetB和tetM基因属于诱导表达,其携带不会增加生存适应度代价,在没有药物压力条件下的生存能力与敏感菌无差异,而在有药环境中,该基因的诱导表达能有效对抗药物的抑制作用,逐渐成为优势菌群;因此,细菌一旦携带此类基因耐药后难以通过停止用药来恢复其敏感性。