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香蕉枯萎病是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害,由尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起,最主要的致病生理小种是1号(Foc1)和4号(Foc4),它们腐生能力很强,在土壤中可长期存活,属于典型的潜伏性侵染。在实际生产中,防治香蕉枯萎病缺乏有效的方法。使用化学药剂、生物防治对香蕉枯萎病的防治效果并不理想,并且种植的抗病品种也易因病原菌的进化而逐渐丧失抗病性,明确香蕉枯萎病的致病分子机理才是解决问题的关键。苯并咪唑类杀菌剂具有广谱、高效和内吸性等特点,被广泛用于防治镰刀菌引起的病害。该类杀菌剂主要作用于病原菌的β-微管蛋白,通过抑制纺锤体的形成,进而抑制有丝分裂,但由于作用位点单一,病原菌在药剂选择压力下较易产生抗药性,使得防治效果下降。另一类氰基丙烯酸酯类杀菌剂氰烯菌酯(JS399-19)是对大多数镰刀菌有很好抑菌活性的新型杀菌剂,有研究得知其主要作用于病原菌的Ⅰ型肌球蛋白,通过抑制病原菌ATPase酶的活性从而阻碍病原菌生长发育。为了揭示相关杀菌剂靶标基因的具体功能,本研究首先测定了香蕉枯萎病菌(Foc4)对多菌灵和氰烯菌酯的敏感性,结果表明,Foc4对这两类杀菌剂都表现为敏感。通过基因克隆并鉴定了 Foc4 β1-tub基因(MF668108),编码蛋白含446个氨基酸;β2-tub基因(MF668109),编码蛋白含448个氨基酸;myosin-1(MG601753)基因,编码蛋白含1228个氨基酸,经过同源比对后发现这3个基因高度保守。然后使用Split-marker基因敲除技术,采用PEG介导的方法进行原生质体转化,通过同源重组分别获得了 Foc4 β1-tub、β2-tub敲除突变体和myosin-1敲除突变体。对这3个敲除突变体的生长表型、相关杀菌剂的敏感性和对巴西蕉苗的致病力进行分析。具体结果为:与Foc4相比,β1-tub敲除突变体的生长速率明显降低,菌丝生长畸形,产孢量增加,对多菌灵的敏感性没有显著变化,对巴西蕉苗的致病力显著降低;β2-tub敲除突变体的生长速率、菌丝生长形态和产孢量没有显著变化,对多菌灵的敏感性增强,对巴西蕉苗的致病力降低;myosin-1敲除突变体的生长速率明显降低,菌丝生长畸形,分支增多,产孢量显著降低,对氰烯菌酯的敏感性显著减弱,对巴西蕉苗的致病力显著降低;此外,还对敲除突变体进行胁迫因子的敏感性测定,结果发现,3个敲除突变体对细胞壁选择性压力、氧化压力和渗透压均表现为不敏感。以上结果表明β1-tub、β2-tub和myosin-1基因在Foc4的生长发育、致病力以及对杀菌剂的敏感性方面发挥重要作用。本研究丰富了香蕉枯萎病菌的致病机理,并为新的杀菌剂靶标的开发提供参考。