肿瘤细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平升高是肿瘤细胞的一个特征。ROS在肿瘤的发生发展过程中起了重要作用。虽然靶向ROS是潜在的肿瘤治疗方向,肿瘤细胞产生ROS的分子机理并不完全清楚。因此,研究肿瘤细胞产生ROS的机制或生物化学途径将有助于加深对肿瘤细胞生物学的理解。双氧水是重要的ROS种类之一。目前研究认为,双氧水主要来自于超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）催化的超氧离子歧化;也有研究认为,超氧离子（Superoxide,O2-）可启动脱氢酶催化自由基链式反应、氧化NADH产生双氧水。基于肿瘤细胞内线粒体可产生大量超氧离子,肿瘤细胞的高速率糖酵解代谢可提供大量NADH以及肿瘤细胞中含有大量乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）,我们推测,肿瘤细胞内超氧离子可启动LDH氧化NADH产生双氧水。为验证此假设,开展了如下研究:1.检测肿瘤细胞中两个主要的LDH亚型LDHA和LDHB催化产生双氧水的酶活性。在无细胞反应体系中,LDHA和LDHB均可催化产生双氧水,并呈NADH浓度和酶浓度依赖性,其催化作用可被LDH抑制剂FX11（NADH结合位点）和oxamate（丙酮酸结合位点）抑制。肿瘤细胞、正常组织或实体肿瘤中分离得到的线粒体可增强LDHA和LDHB催化产生双氧水的活性。在人宫颈癌细胞系He La和小鼠乳腺癌细胞系4T1中,敲除LDHA和LDHB可降低细胞产生双氧水的速率;敲除LDHA后再表达LDHA,可相应恢复细胞产生双氧水的活性。说明LDH在酶学系统中和肿瘤细胞内均能促进双氧水的产生。2.上述实验说明LDH具有促氧化作用。使用FX11抑制LDH活性或用si RNA敲低LDH表达后,肿瘤细胞内及线粒体内ROS水平增高,说明LDH具有抗氧化作用。构建了线粒体DNA缺失细胞ρ0细胞,在ρ0细胞中,用FX11抑制LDH活性或用si RNA敲低LDH表达后,细胞及线粒体内ROS水平降低,说明在ρ0细胞中,LDH具有促氧化作用。在LDH活性抑制细胞中使用不同浓度的线粒体复合物III抑制剂antimycin处理,结合细胞内ROS信号定量,证明LDH的抗氧化和促氧化作用同时存在,并在不同ROS背景下两者优势不同,并分析了其与线粒体功能的相关性。3.为了进一步探究LDH与细胞内ROS的关系,用线粒体电子传递链调节剂rotenone,antimycin,FCCP,oligomycin处理He La和4T1细胞。实验发现,rotenone,antimycin,FCCP,oligomycin均能升高肿瘤细胞内和线粒体内ROS水平;用LDH抑制剂FX11抑制LDH活性,或用CRISPR/Cas9敲除LDHA或LDHB后,上述小分子所诱导细胞内ROS水平上升幅度降低,而线粒体内ROS水平基本不变。结合研究结果1,说明该四种电子传递链调节剂产生的超氧离子可启动LDH催化反应,即LDH具有放大细胞内ROS水平的作用。4.抗肿瘤制剂荜拔酰胺（Piperlongumine,PL）、异硫氰酸苯乙酯（Phenethyl isothiocyanate,PEITC）被认为通过升高肿瘤细胞内ROS水平来杀伤肿瘤细胞,但其中机制未明。PL、PEITC处理He La、4T1细胞后细胞内及线粒体内ROS水平升高,而LDHA或LDHB敲除细胞中PL、PEITC所诱导的细胞内ROS水平降低,而线粒体内ROS水平不变,说明PL、PEITC诱导的超氧离子可启动LDH催化反应,放大细胞内ROS水平。5.用LDHA或LDHB基因敲除细胞分别进行小鼠皮下荷瘤实验,研究LDH对肿瘤内ROS水平及肿瘤进展的影响。LDHA或LDHB敲除后肿瘤生长减慢,肿瘤远处转移减少。同时LDHA或LDHB敲除肿瘤内氧化应激水平标记物4-HNE（4-Hydroxynonenal）、DNP（2,4 Dinitrophenol）水平降低,低氧诱导因子HIF1-α（Hypoxia inducible factor-1α）水平降低。敲除LDHA或LDHB后,肿瘤内ROS水平降低,肿瘤生长抑制及远处转移减少,提示LDH的促氧化作用与肿瘤生长转移相关。上述研究从酶学系统层面证明线粒体来源的超氧离子启动LDH催化产生双氧水的级联反应,从细胞层面阐明LDH在肿瘤细胞内同时具有抗氧化和促氧化功能并与线粒体功能有关,利用体内实验验证了LDH的促进ROS功能与肿瘤进展和转移的相关性。基于以上研究,我们提出LDH在促进肿瘤细胞内ROS过程中具有重要作用。本研究解释了肿瘤细胞内双氧水/ROS产生的新机制,对深入理解肿瘤氧化胁迫具有科学意义,对基于ROS水平干预的创新型肿瘤治疗方案的开发具有指导意义。