万古霉素是目前临床上用于治疗由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的严重感染的首选药物。随着其广泛的使用,万古霉素耐药的肠球菌、金葡菌相继出现,预计在不久的将来会出现完全耐糖肽类抗生素的金黄色葡萄球菌(GRSA)。基于此情形,开发新型糖肽类抗生素势在必行。随着分子生物学方法的不断进步,利用组合生物合成改造糖肽类抗生素已成为研究的热点。组合生物合成方法创造“非天然的天然化合物”是建立在对基因簇中编码各个酶的基因功能深入了解的基础上的。本文通过体内基因敲除和体外酶活反应对东方拟无枝酸菌万古霉素生物合成基因簇中可能与N-甲基化反应和卤化反应相关的四个基因vcm12、vcm11、vcm14和vcm8的功能进行研究,为组合生物合成改造万古霉素提供正确信息。同时在该过程中获得的万古霉素类似物有可能作为杂合万古霉素开发的母核。对推测的N-甲基转移酶基因vcm12进行敲除,得到遗传稳定的突变株A.orientalis dvcm12。同时构建了vcm12的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLYLH13,诱导表达后经镍柱纯化得到蛋白Vcm12,进行体外酶催化反应。突变株产物的研究结合体外酶反应结果证实vcm12为N-甲基转移酶基因。同时发现除vcm12外还有其他的基因参与N-甲基化反应。在体外酶催化反应时发现N-甲基转移酶Vcm12对万古霉素类似物(N-去甲万古霉素,无氯万古霉素,单糖万古霉素和无糖万古霉素)均有双甲基化现象。通过对产物的研究确定了双甲基化位点,即在万古霉素7肽骨架1位亮氨酸的氨基上有两个甲基。对推测的C3-甲基转移酶基因vcm11进行敲除,得到遗传稳定的突变株A. orientalis dvcm11。对突变株代谢产物的研究印证了该基因的C3-甲基转移酶功能。同时发现vcm11的缺失会有N-去甲基的万古霉素类似物产生,推测该基因可能还具有N-甲基转移酶的功能,该发现为N-甲基化反应的研究提供了重要线索。此外,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/ pLYLH16,诱导表达该菌得到C3-甲基转移酶Vcm11。根据基因序列比对推测万古霉素的生物合成基因簇中有两个卤化酶基因:卤过氧化物酶基因vcm14和FADH2依赖型卤化酶基因vcm8。分别敲除这两个基因后得到遗传稳定的突变株A. orientalis dvcm14和dvcm8。突变株的发酵产物研究排除了vcm14参与卤化反应的可能性,证实万古霉素卤化反应只有一个卤化酶,即vcm8编码的FADH2依赖型卤化酶,且该酶同时负责两个氯原子的催化。在A. orientalis dvcm14发酵时加入β羟基酪氨酸会产生万古霉素,该氨基酸添加实验表明vcm14为一个β羟基酪氨酸合成酶。此外,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pLYLH20,诱导表达后得到蛋白Vcm8。在对该四个基因的敲除和酶活实验中共发现12个万古霉素类似物LH02 ~ LH13,其中有4个为新的万古霉素类似物,可为杂合万古霉素的研究提供不同的母核。