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背景:支气管哮喘(简称哮喘)是一种作用于呼吸气道的异质性疾病,同时伴有可变的气流受限和气道高反应性,气道炎症贯穿整个疾病的发生发展过程。目前全球患病人数接近3亿,且患病率仍呈现不断上升的趋势,预计到2025年患病人数将达到4亿。随着分子生物学的不断发展,哮喘发病机制的假说也不断更新,目前广泛认为哮喘的发生发展与多种机制相关,主要包括气道变态反应、气道炎症机制、气道神经调节失衡机制及气道重构等,其中气道炎症机制在哮喘的发病过程中扮演着重要的调控作用。有研究表明,哮喘的发生发展与免疫学关键分子、炎症信号通路的传递有着莫大的关联。细胞间的信息传递在人体诸多生理功能的发挥占据重大的作用。近年来,外泌体受到了广泛的关注,是一种能被多种细胞所释放的囊泡状小体,包括蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等生物活性物质,可介导细胞间的通讯而参与免疫应答、抗原呈递、炎症反应和细胞迁移等多种病理生理过程。越来越多的证据表明外泌体(exosomes)与哮喘之间有着密切的关联,并认为外泌体有促进哮喘炎症反应的作用。我们在前期的研究结果中发现:哮喘的发生可能与外泌体的释放量增多相关,其可能是导致哮喘气道炎症恶化的关键因素之一。因此,本研究通过以豚鼠哮喘模型中血清来源的外泌体作为研究对象,从细胞分子水平层面探讨外泌体是否介导哮喘的气道炎症及其具体发病机制,为哮喘的诊疗提供理论支持。目的:探讨血清来源的外泌体对BEAS-2B细胞的促炎作用及其介导哮喘的具体发病机制。方法:1、雌性豚鼠(250±5g)随机分为对照组和HDM哮喘组,HDM哮喘组采用屋尘螨提取液(houst dute mite,HDM)对豚鼠致敏和激发来诱导哮喘模型,对照组使用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffers,PBS)代替;收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和血液,并对哮喘模型进行鉴定。2、ExoQuick试剂盒从哮喘豚鼠的血清中分离提取exosomes,透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察其形态学特征和免疫印迹法(western blotting,WB)测定exosomes的标志性蛋白CD63和HSP70。荧光染料PKH67染色exosomes,DAPI染色细胞核,观察其被BEAS-2B细胞摄取情况。3、不同时间段,对不同浓度血清来源的exosomes处理BEAS-2B细胞,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测炎症细胞因子的表达情况。4、血清来源的exosomes处理BEAS-2B细胞,WB检测BEAS-2B细胞中TLR4、IKK-a/b和p-65的蛋白表达;免疫荧光检测P-65蛋白入核情况。5、TLR4阻断剂TAK242和NF-kB阻断剂Bay11-7082处理BEAS-2B细胞后,加入血清来源的exosomes共培养,RT-PCR和ELISA检测其对BEAS-2B炎症因子分泌产生的影响。6、不同浓度的TLR4阻断剂TAK242处理BEAS-2B细胞后,加入血清来源的exosomes共培养,WB检测BEAS-2B细胞中TLR4、IKK-α/β和p-65的蛋白表达。7、筛选血清来源的exosomes中的哪种成分对BEAS-2B炎症因子分泌产生的影响,并通过阻断剂和体外重组蛋白进一步验证。结果:1、HDM致敏的豚鼠雾化激发后出现呼吸困难,鼻部瘙痒,烦躁不安,大小便失禁,毛发竖起等症状的表现。2、肺组织病理切片显示HDM组出现支气管黏膜下水肿,黏液腺增生,周围肺组织以大量中性粒细胞、淋巴细胞和少量嗜酸性粒细胞浸润为主。3、与对照组比较,HDM组BALF中细胞总数及淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等均增高(P<0.001)。与对照组比较,哮喘豚鼠BALF上清中IL-4,IL-13的水平显著升高(P<0.001)。4、与对照组比较,HDM组血清中外泌体的蛋白浓度明显增高(P<0.001)。电镜结果显示两组血清中exosomes的直径大小在30-100nm之间。血清来源的exosomes可以被BEAS-2B细胞摄取,其能增加BEAS-2B中促炎因子IL-6和生长因子NGF的表达。5、HDM组血清来源的exosomes可以激活TLR4/NF-kB信号通路,导致TLR4、p-IKK-α/β和p-P65蛋白的表达增加,P65蛋白进入核内导致促炎因子IL-6和生长因子NGF的表达增加。阻断TLR4/NF-kB信号通路后可以抑制p-65的活化,导致IL-6和NGF的表达水平下降。6、血清来源的exosomes中的HSP70可能参与TLR4/NF-kB信号通路促进炎症因子IL-6和生长因子NGF的表达增加。HSP70的阻断剂HSP70-IN-1可以抑制血清来源的exosomes促炎作用,体外重组蛋白HSP70与血清来源的exosomes具有相似的促炎作用。结论：HDM致敏和激发可以成功复制豚鼠过敏性哮喘模型。血清来源的外泌体可以发挥促炎作用,可能通过诱导其表面的膜蛋白HSP70表达进一步活化TLR4/NF-kB信号通路的表达参与哮喘的发病。