FK506、MMF、anti-CD28mAb联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究研究背景目前，器官移植已经成为临床治疗终末期疾病的有效和常规措施。然而，尽管由于外科技术的标准化、免疫抑制剂的不断研发和应用，在过去20年间，移植物的长期存活率仍未明显提高。免疫抑制剂的成功应用，有效地抑制了急性排斥反应，但不能有效地控制可导致移植物失功的慢性排斥反应的发生。而且，免疫抑制剂的长时间应用，不可避免地产生感染、肿瘤等并发症。因此，意味着移植物可长期存活的免疫耐受的诱导，成为移植学家和免疫学家所追求的目标。在啮齿类动物，已有许多可行的策略成功诱导出血管化移植物的长期存活。但应用这些策略过渡到临床，由于在大动物模型中得不到相同的结果，却受到了限制。回顾近年来这一领域的研究成果，多集中在拟通过建立供受体细胞的混合性嵌合状态，来诱导移植物的免疫耐受，尤其是通过新型的、无明显毒副作用的建立混合性嵌合的处理方案。本研究正是基于以上观点，试图建立一种无明显毒副作用、非骨髓抑制的处理方案，通过建立大鼠肝移植模型，采用以FK506、MMF、anti-CD28mAb为主并联合供者骨髓输注的处理措施，来诱导大鼠肝移植免疫耐受。同时，进一步分析其诱导长期存活的可能机制，包括移植物和外周血中细胞因子的表达、细胞凋亡的发生在免疫耐受诱导中的可能作用等。本部分研究的具体内容总结如下：第一部分目的：利用套管技术建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型，模型的建立是本项研究的基础。方法：采用“二袖套法”完成200例次大鼠原位肝移植模型，同时结合自己的体会，对“二袖套法”进行适当改进，包括套管的制作、受体的麻醉、腹主动脉的灌注以及肝上、肝下下腔静脉、门静脉等血管的吻合。结果：肝上下腔静脉的吻合时间为10～15分钟，无肝期为12～18分钟，一周生存率可达75％以上。术后常见的并发症为出血、血栓形成、感染以及胆道梗阻。结论：技术的改进增加了生存率，包括供肝腹主动脉灌注，在供肝的质量上明显优于单纯门静脉灌注。另外，减少供肝的机械性损伤、避免套管的扭曲、提高血管的吻合质量以及缩短无肝期，都是减少术后并发症和提高移植物存活的关键。<WP=6>第二部分目的：观察大鼠肝移植受体采用以FK506、MMF、anti-CD28mAb为主并联合供者骨髓输注的处理措施，对移植肝存活时间的影响以及排斥反应的发生。方法：通过建立Wistar→SD大鼠原位肝移植模型，实验共分6组：A组：同品系移植组：（Wistar→Wistar；SD→SD，N=6）；B组：免疫排斥组；不用任何治疗措施，（Wistar→SD，N=14）；C组：免疫移制剂FK506、MMF术后联合应用2天，（Wistar→SD，N=7）；D组：免疫抑制剂FK506、MMF术后联合应用2天，然后单独应用FK506共4天，（Wistar→SD，N=6）；E组：D组＋骨髓输注组：术后尾静脉输注供体骨髓细胞，（Wistar→SD，N=6）；F组：免疫抑制剂FK506、MMF术后联合应用2天并术后第一天anti-CD28mAb应用一次，然后单独应用FK506共2天＋骨髓输注组：术后尾静脉输注供体骨髓细胞，（Wistar→SD，N=3），观察移植物的存活和排斥情况。结果：同品系肝移植均可存活100天以上；免疫排斥组肝移植大鼠术后15.5天死于急性排斥反应；骨髓输注组即E组和F组肝移植大鼠存活超过100天，病理学检查门脉周围和肝组织内未见明显细胞浸润。结论：Wistar→SD大鼠间肝移植，属于高免疫排斥型动物组合，可以有效作为大鼠肝移植免疫排斥和免疫耐受研究的品系组合；移植的同时联合供者骨髓细胞的输注可获得移植肝的长期存活；抗CD28单克隆抗体和短时间FK605、MMF联合应用具有协同作用。第三部分目的：研究大鼠肝移植术后移植肝和外周血中细胞因子的表达，并分析其与急性排斥反应和耐受诱导的关系。方法：实验共分4组，A、B、C、D组，分别和第二部分的A、B、D、E组相同。术后6天分别获取移植肝和外周血标本，每组8份。采用RT-PCR和ELISA技术分别检测移植肝和外周血中，和排斥反应和免疫耐受可能有关的细胞因子IL-2、INF-gamma、IL-4、IL-10、TGF-beta 1的表达。结果：在B组中Th1型细胞因子（ IL-2, INF-gamma）的表达高于C组和D组；而Th2 型细胞因子（IL-4、IL-10）、TGF-beta 1的表达，B组低于C组和D组；细胞因子在C组和D组中表达无明显差别。结论：Th1型细胞因子（ IL-2, INF-gamma）参与肝移植急性排斥反应的发生，而Th2 型细胞因子（IL-4、IL-10）和TGF-beta 1可能参与了移植物免疫耐受的诱导。第四部分目的：探讨大鼠肝移植移植物和外周血中的细胞凋亡对诱导移植受体存活的影响，并分析骨髓输注诱导移植肝长期存活的机制。方法：实验分组同第三部分，术后6天分别获取移植肝和外周血标本，每组8份。采用流式细胞检测和TUNEL技术分别<WP=7>检测外周血中和移植物内细胞凋亡。结果：术后6天移植肝和外周血中都可检测到凋亡细胞的存在，细胞计数发现D组中细胞凋亡的发生率明显高于B组和C组，凋亡细胞可为浸润性细胞和肝实质性细胞，但在C组和D组中多以浸润性细胞为主。结论：移植物中早期的细胞凋亡可能和移植免疫耐受的诱导?