拟南芥DRIP1互作蛋白DIF1/2的功能研究

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DREB类蛋白是植物响应水分胁迫的应答过程中重要的转录因子,调控靶基因的表达使植物对不利的外界环境作出适应。有研究表明RING类E3连接酶DRIP1和DRIP2可以通过泛素化DREB2A使其被26S蛋白酶体降解,维持DREB2A在细胞中稳定的蛋白丰度;并推测干旱、热胁迫条件下DRIP1和DRIP2的E3泛素连接酶活性被抑制,DREB2A在细胞内大量积累从而启动下游含DRE/CRT元件的胁迫应答基因表达。研究胁迫条件下DRIP1和DRIP2的E3泛素化连接酶活性是如何调控的,是否存在其它的调控因子,以及该调控因子在胁迫应答过程中起到什么样的作用有待研究。  本文通过基因芯片数据和酵母双杂交方法筛选到一个能特异与DRIP1互作的蛋白,我们将其命名为DIF1(DRIP1-Interacting Factors1),其同源基因表达蛋白命名为DIF2。通过荧光定量PCR实验,我们发现DIF1/2除受到干旱胁迫诱导上调表达以外,还受到ABA、NaCl及AlCl3诱导,两基因的诱导表达模式类似;DIF1pro∷GUS和DIF2pro∷GUS转基因植株组织染色实验也证明DIF1/2受上述因素诱导表达。并且DIF1和DIF2在拟南芥的幼胚、莲座叶、花蕾以及角果中均有表达。DIF1-GFP和DIF2-GFP原生质体亚细胞定位实验中GFP荧光在细胞核及细胞质中均能够观察到,表明DIF1和DIF2蛋白可能在细胞内遍在分布;而在双分子荧光互补实验中,DIF1和DIF2与DRIP1的互作信号仅在烟草细胞的细胞核中观察到,表明DIF1和DIF2与DRIP1在细胞核中互作,这一结果与DRIP1蛋白为核蛋白结果一致。我们获得了DIF1和DIF2的T-DNA插入缺失突变体dif1-1和dif2-2,并构建了DIF1和DIF2的双突变体dif1-1 dif2-2。对三种突变体ABA敏感性的实验分析发现,dif1-1与野生型植株无显著差异,dif2-2和dif1-1 dif2-2双突变体较野生型在萌发阶段表现出不同程度对外源ABA处理的不敏感;同时在高浓度葡萄糖培养基上,三种突变体均表现出对葡萄糖信号不敏感;相反,DIF1和DIF2过表达植株则对外源ABA和葡萄糖更敏感。土壤干旱实验也发现DIF1和DIF2过表达材料对干旱胁迫有更好的耐受性,而相应的突变体则较野生型材料对于旱胁迫更加敏感。以上结果暗示着DIF1和DIF2可能正调控植物水分胁迫的应答,但是其分子作用机制还有待进一步的研究。
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