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柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,简称Xac)侵染寄主的叶片、树枝、果实等,引起柑橘溃疡病,是世界范围内严重危害柑橘生产的一种细菌性病害。环鸟苷酸二磷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是近年来发现的一类细菌中普遍存在的第二信使分子,它参与调节细胞分化、运动性、多种致病毒性因子的产生包括三型分泌系统及效应因子、胞外多糖(EPS)和胞外酶等诸多生物学功能,是细菌致病性的关键调控因子。环鸟苷酸二磷酸由含有GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGC)合成,而由含有EAL或者HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDE)负责降解。环鸟甘酸二磷酸通过结合其受体实现对多种生理功能的多效应调控。目前,在Xacjx-6中发现了 41个c-di-GMP的受体,其中有4个为PilZ蛋白受体,分别为XAC1133、N5MapZ、XAC1971、XAC3518,研究发现,PilZ结构域蛋白XAC1133和EAL结构域蛋白FimX(XAC2398)互作,调控四型分泌系统的功能;首次发现PilZ结构域蛋白XCC6012可以以四聚体的状态存在,而XAC1971和XCC6012是同源蛋白;XAC3518和纤维素酶的合成有关;而N5MapZ作为PilZ结构域c-di-GMP重要的受体蛋白,至今还没有相关报道。已有的研究表明PilZ蛋白通过蛋白和蛋白互作调控生理功能。本论文通过酵母双杂交文库筛选的方法鉴定N5MapZ的互作蛋白,初步鉴定prmC为N5MapZ的互作候选蛋白,进一步对两个基因的突变体进行生物学功能分析,结果暗示这一对蛋白之间互作可能是真实的。该研究可能揭示c-di-GMP受体的新型作用机制。目前初步的研究结果如下:1.N5MapZ互作蛋白的筛选与鉴定。首先我们构建了 Xacjx-6菌株的基因组表达文库,采用酵母双杂交(Y2H)的方法,以N5MapZ蛋白为诱饵蛋白,筛选到两个互作候选蛋白分别是prmC和XAC3490,随后通过细菌双杂交以及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)等主要验证了 prmC 和靶蛋白 N5MapZ 的互作情况。结果表明,在酵母系统中,prmC和N5MapZ这两个蛋白存在很强的互作;在细菌系统里,这两个蛋白的互作不如酵母系统那么强但仍然存在微弱的互作;但是运用Co-IP进行体外验证时,却没有检测到这两个蛋白的互作,因此对于这两个蛋白之间是否存在互作关系仍需要进一步的探究。2.N5MapZ和prmC的生物学功能研究。本研究首先通过同源重组的方法分别构建了 N5MapZ和prmC的缺失突变体菌株△N5MapZ和△prmC、以及同时缺失N5MapZ和prmC基因的的双突变体菌株△prmC△N5MapZ,并对突变体的生物膜、生长速率、胞外酶、运动性、胞外多糖等表型进行了分析。随后又构建了 prmC和N5MapZ的互补菌株C-prmC和C-N5MapZ,并进行了功能互补实验。研究发现相比Xacjx-6,△prmC菌株的生长速率下降、胞外多糖产量降低、胞外酶活性降低、运动能力几乎丧失、形成生物膜的能力上升、且在NYG的液体培养基里有聚集现象产生,而互补体C-△prmC则基本能把△prmC的性状恢复到野生型的水平;△N5MapZ菌株的生长速率、胞外多糖的形成、胞外酶的活性以及运动性都没有明显的变化;而N5MapZ+过表达菌株的运动能力有微弱的降低、且生物膜产量升高。