齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti,S.pregnant）属于地区特种经济冷水鱼类,具有很高的营养、文化和经济价值,广受当地水产品市场欢迎。集约化养殖是齐口裂腹鱼目前主要的养殖模式,但高密集度的养殖环境容易爆发由病原微生物导致的各种疾病,如嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）引起的细菌性败血症。Ah在自然界尤其水体中广泛分布,为条件致病菌,是多种鱼类的原发性致病菌,对渔业养殖产生了巨大的危害。Ah属革兰氏阴性菌,其细胞壁最外层的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是激活机体免疫反应的关键病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）之一。鱼类识别和清除LPS的免疫过程与哺乳动物存在较大的差异,但相关作用机制还不清楚。为阐明齐口裂腹鱼抗Ah的免疫反应机制,本研究结合转录组测序和分子生物学手段,从齐口裂腹鱼对Ah及其LPS的转录响应机制、关键效应基因挖掘、候选基因TLR25和IRF1免疫功能三个方面进行研究。所开展的试验及得到的结果如下:试验一:齐口裂腹鱼对嗜水气单胞菌的转录响应。本试验首先通过HE染色切片观察了齐口裂腹鱼感染Ah后的脾脏组织病变,发现了脾脏淋巴细胞增多的现象。之后,利用转录组测序分析了齐口裂腹鱼感染Ah后的基因表达特征,尤其是免疫相关基因的表达特征。在感染Ah 12 h后,共计获得6,213个差异表达基因（DEGs）,包括3,066个上调DEGs和3,147个下调DEGs。将这些DEGs进行KEGG和GO富集分析,并通过DEGs富集在KEGG数据库的免疫相关信号通路和GO数据库的免疫相关亚类鉴定免疫相关DEGs（IRDs）。从中进一步筛选较为感兴趣的IRDs（包括Toll样受体、补体分子、细胞因子和其它信号分子）绘制热图,并挑选16个潜在的效应基因进行转录组验证分析。根据IRDs的表达水平和已知的研究预测由TLRs介导的潜在信号通路,该通路包括由TLR25和TLR5介导的NF-κB和AP-1信号激活,以及由IRF1和IRF3/7诱导的一型干扰素信号激活,它们可能在齐口裂腹鱼抗菌免疫反应中起着重要的作用。上述试验结果初步揭示了嗜水气单胞菌感染齐口裂腹鱼后的免疫相关基因的转录响应机制,为进一步研究鱼类抗细菌免疫的机制提供了理论基础。试验二:齐口裂腹鱼对嗜水气单胞菌LPS的转录响应。本试验首先通过HE染色切片观察了Ecoli.LPS刺激齐口裂腹鱼后的脾脏和头肾组织病变,发现了脾脏血窦血细胞聚集、头肾淋巴细胞增多和粒细胞减少现象。Anti-LPS免疫组化分析表明LPS与脾脏和头肾免疫细胞间可能存在着相互作用。之后,利用转录组测序分析了齐口裂腹鱼分别在Ah和大肠杆菌来源LPS（Ah.LPS和Ecoli.LPS）刺激后的基因表达特征,尤其是免疫相关基因的表达特征。在Ah.LPS和Ecoli.LPS刺激后,分别获得了921和975个DEGs,其中两种LPS刺激后共有的DEGs为470个。将这些DEGs进行KEGG和GO富集分析,并进一步筛选IRGs,得到了88个共有的IRGs。其中,四个模式识别基因（TLR5、TLR25、PTX3和C1q）的表达水平较高,这可能与LPS识别和信号传导有关。同时,炎症因子（IL-1β、IL-10和IL-8）的表达水平也在LPS刺激后明显上调,说明LPS导致齐口裂腹鱼产生了强烈的炎症反应。此外,不同来源LPS刺激后存在一部分非共有IRGs（包括TLR2和TLR4）,表明不同来源的LPS对免疫基因表达的诱导潜力存在差异。进一步,本研究分析了多个潜在的LPS识别和信号转导相关基因在LPS刺激后的齐口裂腹鱼头肾原代巨噬细胞和粒细胞中的表达变化,发现它们能够不同程度地响应LPS刺激。最后,根据IRDs的表达水平和已知的研究预测,TLR5、TLR25、PTX3和C1q可能是齐口裂腹鱼识别LPS和激活下游免疫信号通路的关键分子。其中,TLR25/TLR5可能介导炎症信号的激活,而PTX3/C1q可能介导补体信号通路的激活。上述试验结果初步揭示了LPS刺激齐口裂腹鱼后的免疫相关基因的转录响应机制,为进一步研究LPS诱导鱼类免疫反应的分子机制提供理论基础。试验三:基于转录组数据筛选和评估qRT-PCR内参基因。实时定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）是基因表达分析的常用方法,但选择稳定的内参基因进行归一化分析必须十分的谨慎。本试验在转录组分析的基础上,结合常用的管家基因,选择了8个候选内参基因（18S、Actin、EF-1α、40S、B2M、TUBA、UBCE和GAPDH）,并分析了它们在病原物刺激后的齐口裂腹鱼脾、头肾和头肾白细胞（HKLs）中的表达稳定性。本实验利用ge Norm、Norm Finder和Bestkeeper 3个程序对候选内参基因的稳定性进行评估,结果发现Actin和EF-1α（稳定性:Actin＞EF-1α）的表达稳定性较高,而18S和GAPDH的表达稳定性较低。进一步,以Actin、EF-1α、18S和GAPDH作为内参基因分析TLR22a在不同病原物处理下的表达水平,结果表明Actin和EF-1α是齐口裂腹鱼在免疫刺激条件下较为稳定的qRT-PCR内参基因（稳定性:Actin＞EF-1α）。上述试验获得了齐口裂腹鱼在免疫刺激条件下较为稳定的qRT-PCR内参基因,为精准分析齐口裂腹鱼基因的表达提供了基础。试验四:齐口裂腹鱼抗菌关键基因TLR25和IRF1的功能分析。本试验通过绘制不同差异比较组的DEGs维恩图获得了59个共有的IRGs,其中包括可能起着关键作用的TLR25和IRF1基因。进一步,本研究从齐口裂腹鱼中克隆了TLR25的编码序列（CDS）,命名为sp TLR25,全长为2,454 bp,编码817个氨基酸。sp TLR25蛋白包含一个信号肽、20个亮氨酸富集（LRR）结构域、一个LRRC末端（LRRCT）基序、一个跨膜区域和一个Toll/IL-1受体（TIR）结构域。分子系统发育分析表明,sp TLR25与鲤鱼（Cyprinus carpio）的TLR25-2亲缘关系最近。3D-同源建模表明sp TLR25的TIR结构含有5个α-螺旋和3个β-折叠,LRR结构含有8个α-螺旋和6个β-折叠。组织表达分布分析发现,sp TLR25基因在免疫相关组织和外周血白细胞（PBLs）中的表达水平较高。此外,sp TLR25基因在LPS和Ah刺激后的脾脏、头肾和肝脏组织中,以及在LPS和Poly（I:C）刺激后的HKLs中的表达水平均明显上调。双荧光素酶报告系统分析表明,sp TLR25能够激活下游NF-κB信号通路,且sp TLR25的TIR和LRR结构均对该信号激活起着重要的作用。利用双荧光素酶报告系统和GST-pulldown分析sp TLR25与下游适配器分子（sp My D88、sp TIRF和sp TIRAP）间的相互作用关系发现,sp TLR25与sp My D88间存在直接的相互作用,说明sp TLR25通过My D88依赖性信号通路来激活下游NF-κB信号通路。亚细胞定位分析显示,sp TLR25表达定位于胞内区域。最后,利用双荧光素酶报告系统筛选和分析sp TLR25特异性识别的PAMPs,结果表明sp TLR25可能作为免疫信号调控的“平衡分子”,而不参与PAMPs的特异性识别。本试验同时也克隆了齐口裂腹鱼IRF1 CDS,命名为sp IRF1,sp IRF1全长为867bp,编码288个氨基酸。多序列比对分析表明,sp IRF1蛋白包含1个较为保守的N-端DNA结合域（DBD）、1个转录激活结构域（TD）和1个C-端IRF关联域2（IAD2）。基于双荧光素酶报告系统分析发现,sp IRF1能够激活I型IFNs信号通路。在Ah和LPS刺激后的齐口裂腹鱼中,sp IRF1与sp IFN（I型IFNs）基因的表达水平被不同程度地提高,其中Ah刺激后的sp IRF1与sp IFN基因表达水平最高,且二者的表达变化可能存在一定的关联性。进一步,通过鲤鱼EPC过表达细胞模型分析显示,sp IRF1能够激活I型IFNs信号通路,且sp TLR25协同调控sp IRF1诱导的I型IFNs信号通路。上述试验结果揭示了TLR25介导的NF-κB信号通路和IRF1介导的I型IFNs信号通路可能在齐口裂腹鱼抗菌和抗LPS免疫反应过程中起着重要的作用,为深入研究鱼类TLR25和IRF1的免疫功能及机制奠定了基础。综上所述,本研究通过转录组分析揭示了齐口裂腹鱼抗Ah和LPS的免疫相关基因的转录响应机制,鉴定了多个潜在的效应基因。结合转录组分析进一步筛选和评估了齐口裂腹鱼在免疫刺激条件下的qRT-PCR内参基因,确定了Actin为最佳内参基因。进一步,通过转录组分析确定了TLR25和IRF1为齐口裂腹鱼抗菌免疫过程中的关键效应基因;之后,通过一系列分子生物学研究手段揭示齐口裂腹鱼TLR25响应多种病原物的刺激,能够通过My D88依赖性信号通路激活NF-κB信号,且协同调控IRF1诱导的I型IFNs信号通路。本研究为鱼类免疫学研究和疾病防控提供了理论基础。