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心肌缺血再灌注(I/R)损伤是心脏缺血恢复血流灌注后损伤加重的现象,其损伤细胞死亡本质与细胞凋亡相关。近年来发现在心绞痛冠脉解痉、心肺脑复苏等情况下均有I/R发生,是造成术后病人病情恶化的重要原因之一,因此寻找减轻I/R的方法已成为一个新的研究热点。GDF15作为一种应激反应蛋白,生理情况下在前列腺和胎盘中高表达,在其他大多数组织中微量表达;但在生理病理和环境应激情况下,如I/R损伤、动脉粥样硬化、心脏高压力负荷和心力衰竭,GDF15在心肌细胞中均大量表达,对心肌细胞的结构和凋亡发挥调节作用。因此,GDF15可以被看做心血管疾病的标志物。目的:首先构建GDF15慢病毒表达载体,包装病毒,建立GDF15稳定过表达的心肌细胞株,之后检测GDF15蛋白对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤凋亡的保护性作用及对自噬的影响;继而阿司匹林(Asp)预处理观察H9c2心肌细胞H/R后GDF15的表达水平,以及Asp通过提高GDF15蛋白表达对细胞凋亡的保护性作用和对自噬的影响。明确GDF15蛋白以及Asp心肌保护作用的机制,为其临床应用提供理论依据。方法:第一部分1.GDF15稳定过表达细胞株H9c2/GDF15的建立构建慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-GDF15-EF1-Puro,和空白载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro分别与pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G包装慢病毒,感染H9c2细胞,嘌呤霉素筛选,最终得到GDF15稳定过表达心肌细胞株H9c2/GDF15及对照细胞株H9c2/Sham。2.建立H9c2细胞H/R损伤模型H9c2细胞生长至铺满80%~90%时,换用模拟缺氧溶液,放入密闭缺氧装置充氮气30 min,在培养箱中模拟缺血,4 h后换用无血清正常培养基模拟再灌注,培养箱中分别复氧2 h、3 h、4 h后,MTT法检测各时间点细胞活性,筛选出最适合的复氧时间点,定为实验中H/R条件,建立H9c2心肌细胞H/R模型。3.检测过表达GDF15对H9c2的影响检测H/R后H9c2/GDF15及对照细胞株H9c2/Sham细胞存活率、细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力测定、凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达。第二部分1.Asp对H9c2细胞H/R损伤的影响不同浓度Asp预处理H9c2心肌细胞后进行H/R处理,MTT法检测Asp干预后的细胞与未干预的细胞的存活率变化,选择适合的复氧时间点。2.Asp预处理后细胞GDF15表达的变化不同浓度Asp干预H/R前后的H9c2细胞,利用Western Bolt检测各组细胞GDF15蛋白表达水平。3.凋亡和自噬相关蛋白的表达检测各组凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达水平。结果:第一部分1.成功构建大鼠GDF15慢病毒表达载体,包装病毒,建立大鼠心肌GDF15过表达细胞株H9c2/GDF15正确构建慢病毒表达载体pCDH-CMV-GDF15-EF1-Puro,建立大鼠GDF15稳定过表达心肌细胞株,与H9c2/Sham组相比,H9c2/GDF15组中GDF15基因mRNA表达水平高6.3倍;GDF15蛋白表达明显增加。证明大鼠GDF15过表达H9c2细胞株构建成功。2.过表达GDF15对H9c2的影响MTT结果显示,在缺氧4h后,对H9c2/GDF15和H9c2/Sham心肌细胞进行2 h、3 h、4 h的复氧干预,各时间点H9c2/GDF15细胞活性均较H9c2/Sham高,存在显著性差异(P<0.01)。细胞培养上清中LDH活力值,相较于H9c2/Sham组,H9c2/GDF15组在H/R后LDH活力值明显降低,存在显著差异(P<0.01)。3.GDF15过表达对H/R所诱发的细胞凋亡的影响Western Blot检测显示,在H/R 2 h时,与H9c2/Sham组相比,H9c2/GDF15组的Caspase-3表达明显减少,具有显著性差异(P<0.01);Bcl-2/Bax值显著增加,具有显著性差异(P<0.01)。4.GDF15过表达对H/R所诱发的细胞自噬的影响Western Blot检测显示,缺氧4 h后,与H9c2/Sham组相比,H9c2/GDF15组Beclin-1表达明显增加,具有显著性差异(P<0.01),在H/R 2 h时,与H9c2/Sham组相比,H9c2/GDF15组Beclin-1表达明显增加,具有显著性差异(P<0.01);同样,LC3Ⅱ的表达明显增加,具有显著性差异(P<0.01)。第二部分1.Asp干预对H9c2细胞H/R损伤的影响MTT结果显示,随着Asp浓度的不断增加,H9c2-Asp-H/R和H9c2-H/R细胞存活率均呈递减趋势,但在相同浓度下,相较于H9c2-H/R组,H9c2-Asp-H/R组细胞存活率增高,具有显著性差异(P<0.01)。2.Asp预处理对H9c2细胞H/R损伤后GDF15表达的影响不同浓度的Asp预处理各组细胞48 h后行H/R 2 h、3 h、4 h,在复氧2 h时,相较于H9c2-H/R组,H9c2-Asp-H/R组GDF15的表达显著增加,具有统计学意义(P<0.01)。3.Asp预处理对H9c2细胞H/R损伤后凋亡与自噬的影响用不同浓度Asp预处理各组H9c2细胞,相较于H9c2-H/R组,H9c2-Asp-H/R组Caspase3蛋白表达显著减少(P<0.01),Bcl-2/Bax的比值明显增加(P<0.01),Beclin-1的表达显著增加(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明显增加(P<0.01)。结论:1.成功构建GDF15稳定过表达心肌细胞株H9c2/GDF15及其阴性空载体对照细胞株H9c2/Sham。2.上调大鼠心肌细胞H9c2的GDF15蛋白水平可保护心肌细胞,减轻H/R损伤,其保护性作用机制可能通过促进细胞的自噬作用得以实现。3.Asp预干预可增加GDF15的表达,提高细胞的自噬程度,从而减轻H/R所诱发的细胞损伤。