葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用。本论文建立了一套操作简单且易于工业化应用的黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的提纯方案,并系统研究了其酶学性质。 本试验以实验室所保存的一株黑曲霉A9为发酵菌株,采用10L发酵罐生产葡萄糖氧化酶,发酵四天,得菌丝体,经过破壁,缓冲液提取,获得胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液,然后经超滤浓缩、硫酸铵盐析、Sephadex G-25脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析及Sephadex G-100凝胶层析进行分离纯化。试验结果表明,通过控制离子交换层析与分子筛层析这两步的具体操作条件,大部分杂蛋白被除去,所得酶蛋白经PAGE电泳鉴定为单一条带,达到电泳纯,测定该纯化酶的比活达349.84 U/mg,比初始发酵液提高了15.83倍,酶蛋白得率达到23.75%。 在获得纯化葡萄糖氧化酶的基础上,对其酶学性质进行了系统研究。经SDS-PAGE测定,葡萄糖氧化酶的分子量为138,200 Da,由两个相同的亚基组成,每个亚基的分子量约为70,210 Da。硫酸.苯酚法测得其糖基化程度为2.67%。葡萄糖氧化酶底物专一性强,以葡萄糖为底物,采用双倒数作图法,测定其Km值为35.74mmol/L,Vmax值为35.71 μmol/min。酶蛋白的最适pH为6.7,最适温度为30℃。该酶的pH稳定范围较宽,在pH4～8范围内较稳定,在pH5.0～5.5范围内保温2天,酶活基本不变,在pH6.0～8.0范围内保温也较稳定,酶活均保持在72%以上,pH4.0时酶活下降至60%左右。该酶在30～50℃范围内热稳定性良好,酶活基本不变,均保持在90%以上;60℃处理70分钟,还残存51%的活力,可见该酶可用于温度较高的反应,这对于工业化应用具有一定的价值,因为高温在一定程度上可减少杂菌污染,降低生产成本。金属离子对酶的催化反应有一定影响,Ag⁺、Hg²⁺、亚硫酸氢钠对酶蛋白有强烈的抑制作用,Cu²⁺、Fe²⁺则表现稍微的抑制作用,而Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺等具有不同程度的激活作用。 本论文对葡萄糖氧化酶的提取、纯化及酶学性质做了基础性研究,为进一步研究GOD的催化机理、分子克隆以及工业化应用提供了一定的理论指导。