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目的:研究基因NEDD4L在肾透明细胞癌中的表达及对肾透明细胞癌细胞系生长、迁移等生物学功能的影响,初步探讨NEDD4L在肾透明细胞癌中的相关作用机制,为诊断和治疗肾透明细胞癌提供理论依据和实验基础。方法:1.采用TCGA数据挖掘分析肾透明细胞癌及癌旁正常组织中NEDD4L的表达情况,及NEDD4L的表达与肾透明细胞癌患者生存期之间的关系。2.应用免疫组织化学染色的方法检测25对肾透明细胞癌组织及其癌旁正常组织中NEDD4L蛋白的表达情况。3.应用qRT-PCR分析50对肾透明细胞癌组织及其癌旁正常组织中NEDD4L mRNA的表达情况,并采用χ2检验进一步分析NEDD4L mRNA的表达与肾透明细胞癌患者的临床病理学特点之间的关系。4.应用Western Blot检测人正常肾细胞293T和人肾透明细胞癌细胞ACHN、A498、Caki-1、786-0中NEDD4L的表达情况。采用慢病毒感染的方式将NEDD4L过表达载体和空载体导入人肾透明细胞癌细胞株786-0和ACHN中,构建NEDD4L过表达和空载对照稳转细胞株,并结合qRT-PCR、Western Blot等手段对NEDD4L的表达进行验证。5.通过WST-1法增殖实验、平板克隆形成实验检测过表达NEDD4L对786-0和ACHN细胞的增殖能力的影响,通过Transwell体外迁移模型和细胞划痕实验检测过表达NEDD4L对786-0和ACHN细胞的迁移能力的影响。6.分别在裸鼠皮下接种已构建成功的稳转NEDD4L过表达载体和空载对照的细胞株ACHN NEDD4L和ACHN NC,通过裸鼠成瘤实验在体观察过表达NEDD4L对人肾透明细胞癌细胞移植瘤的生长影响。结果:1.TCGA数据挖掘显示NEDD4L在肾透明细胞癌组织较癌旁正常组织明显低表达,且NEDD4L低表达患者比高表达患者具有更低的总体生存率。2.免疫组织化学染色显示:在25对肾透明细胞癌组织及其癌旁正常组织中,NEDD4L蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.0001)。3.qRT-PCR结果显示:在50对肾透明细胞癌组织及其癌旁正常组织中,NEDD4L mRNA在肾透明细胞癌组织中的表达较癌旁正常组织明显低表达(P<0.001),并且NEDD4LmRNA的表达水平越低,肾透明细胞癌的临床病理组织学级别越高(P<0.05)。4.Western Blot检测显示:NEDD4L蛋白在人肾透明细胞癌细胞株ACHN、A498、Caki-1、786-O中较人正常肾细胞293T呈现低表达。采用NEDD4L过表达载体和空载慢病毒感染ACHN和786-0细胞株,并采用嘌呤霉素筛选从而构建稳定NEDD4L过表达载体及空载对照细胞:786-O NEDD4L、786-O NC;ACHN NEDD4L、ACHN NC。qRT-PCR 鉴定可见:786-O NEDD4L 中 NEDD4L mRNA 的表达水平显著高于 786-O NC(P<0.001);ACHN NEDD4L 中 NEDD4L mRNA的表达水平显著高于ACHN NC(P<0.01)。Western Blot鉴定显示:786-O NEDD4L中NEDD4L蛋白的表达水平显著高于786-O NC(P<0.0001);ACHN NEDD4L中NEDD4L蛋白的表达水平显著高于ACHNNC(P<0.001)。5.体外观察肾透明细胞癌稳转细胞株的生长及迁移能力。WST-1法增殖实验结果显示:在培养48h后,786-O NC组细胞增殖速率明显大于786-O NEDD4L组(P<0.001);ACHNNC组细胞的增殖速率明显大于ACHNNEDD4L组(P<0.01),提示NEDD4L的过表达能明显抑制786-O及ACHN的细胞增殖能力。平板克隆实验结果进一步显示:786-O NC组细胞克隆数明显多于786-O NEDD4L组(P<0.001);ACHN NC组细胞的克隆数明显多于ACHN NEDD4L组(P<0.001),提示NEDD4L的过表达能明显抑制786-O和ACHN的细胞克隆形成能力。Transwell迁移实验发现:细胞加入Transwell小室24小时后,786-O NC组细胞迁移个数明显多于786-ONEDD4L组(P<0.01);ACHNNC组细胞迁移个数明显多于ACHN NEDD4L组(P<0.01)。细胞划痕实验结果显示,786-O细胞系的两组细胞在划痕12小时后,786-O NC组细胞迁移距离明显长于786-ONEDD4L组(P<0.01)。ACHN细胞系的两组细胞在划痕24小时后,ACHN NC 组迁移距离明显长于 ACHN NEDD4L 组(P<0.001)。Transwell 迁移实验和细胞划痕实验结果显示肾透明细胞癌细胞中NEDD4L的过表达可以明显抑制细胞的迁移能力。6.细胞接种10天左右,接种ACHN NC细胞的皮下部位可以触及实性包块。然而有2只接种ACHNNEDD4L细胞的裸鼠相应的皮下部位未能触及实性包块,约16天左右可以触及很小的实性包块。处死并解剖裸鼠后,切下肿瘤组织进行测量,ACHNNC组肿瘤体积明显大于ACHNNEDD4L组(P<0.05)。裸鼠成瘤实验研究显示NEDD4L的过表达可以降低ACHN细胞在裸鼠皮下的成瘤能力,同时抑制肿瘤在体内的生长。结论:1.NEDD4L蛋白和mRNA在肾透明细胞癌中低表达,NEDD4L mRNA低表达与肾透明细胞癌病理组织分级有关。2.NEDD4L低表达与肾透明细胞癌患者总体生存率下降显著相关。3.NEDD4L抑制了肾透明细胞癌细胞的生长和迁移,并且抑制了肾透明细胞癌细胞在裸鼠体内成瘤能力以及移植瘤的生长。