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聚酮化合物是一类具有多种生物活性的次生代谢产物,由聚酮合酶催化多步反应合成。聚酮合酶可以分为三个结构类型:I、II和III型。概括来说II型聚酮合酶的结构特点是每一个催化功能,由一个独立基因编码聚酮合成过程中,酰基中间体由独立酰基载体蛋白供应。对II型聚酮合酶的研究结果暗示II型聚酮合酶是多亚基蛋白复合物。
本文用pGEX-6p-1为载体超表达并部分纯化了jadomycin聚酮合酶五个亚基以及actinorhodin聚酮合酶的六个亚基。用jadomycin的ACP的融合蛋白进行GST Pulldown的初步尝试表明,jadomycin的ACP亚基可能和一个48 kDa左右大小的蛋白相互作用。
用部分纯化的actinorhodin生物合成聚酮合酶的ketoreductase以及ketosynthase的GST融合蛋白制备了兔抗血清。用纯化的抗ketoreductase的抗体进行的针对聚酮合酶的免疫共沉淀捕获的蛋白进行SDS-PAGE,可以在银染的条件下观察到若干蛋白条带,但进一步分析证实在胶上看到的可能与聚酮合酶复合物蛋白为假阳性。
本文也重新全序列合成了TAP(Tandem Affinity Purification)亲和标签,使之适合在链霉菌中表达,并将TAP标签构建到链霉菌接合转移通用载体pSET152上。用Western跟踪actinorhodin的ketoreductase的TAP亲和纯化表明,可以对ketoreductase进行TAP纯化。但是,经过TAP亲和纯化的蛋白得率很低,很难进行质谱鉴定。
用actinorhodin的ketoreductase和ketosynthase抗体对actinorhodin聚酮合酶进行细胞分级定位发现,ketoreductase和ketosynthase都在Streptomyces coelicolorA3(2)的细胞膜级分里。用普通的表面活性剂Triton X-100,CHAPS,辛基葡萄糖苷不能成功将ketoreductase和ketosynthase从细胞膜级分中溶解出来。而1%SB3-10可以将它们溶解出来。
本文同时探索了用Blue Native/SDS电泳对S.coelicolor的细胞质蛋白进行复合物的鉴定分析。发现,用S.coelicolor的全蛋白提取液进行Blue Native/SDS电泳,电泳凝胶有比较高的背景。将全蛋白提取液分为胞质蛋白和膜蛋白,则胞质蛋白可以进行电泳,但是凝胶依然有一定程度的背景。用硫酸氨将胞质蛋白沉淀出来,溶解后再进行Blue Native/SDS电泳,可以得到比较好的结果。为了进一步验证方法的有效性,本文同时对22个蛋白点进行了质谱鉴定。鉴定结果证实已经发现的S. coelicolor蛋白复合物,同时也发现了新的蛋白复合物。