论文部分内容阅读
c-Abl属于非受体酪氨酸激酶,是Abelson鼠白血病病毒原癌基因v-abl在人类上的同源基因。c-Abl广泛分布于各组织细胞当中,主要通过结合并且磷酸化其底物蛋白发挥功能;c-Abl可参与细胞增殖、细胞分化、肿瘤发生形成、DNA损伤修复、细胞骨架生成、细胞凋亡、细胞氧化应激等生理功能调控。c-Abl相关蛋白Arg,与c-Abl在结构上高度同源,发挥相似的功能。FoxM1是一个主要存在于增殖分化细胞中的转录因子,属于FOX蛋白家族,它通过调控基因的转录表达参与细胞增殖、细胞周期调控、DNA损伤修复、肿瘤发生形成、胚胎发育及组织器官再生、细胞凋亡等生理过程。由于两者密切参与细胞周期进程、肿瘤发生形成、DNA损伤修复等,且先前已有报道,c-Abl能够调控p53、NF-κB、C/EBPβ等转录因子,因此c-Abl对FoxM1的调控机制值得探讨。我们前期的研究发现,过表达的c-Abl能够结合并且磷酸化FoxM1,我们通过质谱分析(LC-MS/MS)鉴定出5个主要的磷酸化位点(分别为Y129、Y272、Y317、Y362、Y575)。本研究将对两者的相互作用,c-Abl对FoxM1的磷酸化修饰进行更深入的探讨,并着重研究c-Abl调控FoxM1的分子机制和生理意义,包括泛素化调控、表达水平调控和转录功能调控,以及这些调控作用对细胞周期进程和细胞凋亡的影响。在本研究中,我们首先使用免疫共沉淀、免疫印迹和激光共聚焦等技术手段,证实内源性的c-Abl与FoxM1存在相互作用,相互作用主要定位于细胞核,且主要发生于有丝分裂期(M期)。进一步,我们证实内源性FoxM1可被酪氨酸磷酸化修饰,并且c-Abl激酶特异性抑制剂STI571能够显著抑制FoxM1酪氨酸磷酸化。接下来,我们研究c-Abl对FoxM1表达水平的影响,发现c-abl/arg被敲低或敲除后,FoxM1的表达水平也出现明显下调;同时发现,使用STI571抑制细胞中的c-Abl激酶活性,也能够显著下调FoxM1的表达水平,说明FoxM1的表达依赖于c-Abl激酶活性。我们使用放线菌酮(CHX)处理细胞,抑制蛋白质合成,检测MEF WT细胞和MEF(c-abl-/-/arg-/-)细胞中FoxM1蛋白的半衰期,发现c-abl/arg敲除后,FoxM1的半衰期显著缩短,说明c-Abl/Arg能够增强FoxM1的蛋白稳定性。我们猜测,c-Abl对FoxM1的磷酸化调控其经泛素--蛋白酶体途径降解,导致其表达水平受到影响。为此,通过使用STI571和蛋白酶体抑制剂MG132处理U2OS细胞,检测FoxM1的泛素化程度和蛋白表达水平,发现STI571处理显著增强其泛素化程度并下调其表达水平;而MG132处理能够使其表达水平明显回升,说明c-Abl能够抑制FoxM1的泛素-蛋白酶体降解途径,从而提高FoxM1的表达水平。进一步,我们对FoxM1磷酸化突变体的泛素化修饰和表达水平进行鉴定,发现与野生型FoxM1相比较,Y272F、Y575F及Y272/575F突变体的泛素化程度显著增强,表达水平明显下调,同时与E3泛素连接酶组件CDH1的结合作用显著增强,说明c-Abl对Y272和Y575这两个位点的磷酸化,对FoxM1的稳定性有重要作用。同时发现Y317F、Y362F突变体的表达水平明显升高,并且CDH1与它们的结合作用显著减弱,提示c-Abl对Y317、Y362的磷酸化可能促进FoxM1蛋白的降解。FoxM1通过调节大量的关键基因参与细胞周期调控,这些基因蛋白包括Cyclin B1、Cyclin D1、CDC25A、Plk1、CENP-F、Aurora-A及Aurora-B等。既然c-Abl能够磷酸化并调控FoxM1表达水平,那么对FoxM1转录功能的影响也值得探讨。我们发现,当abl/arg被敲低后,细胞中的FoxM1及其下游靶基因蛋白Cyclin B1、Cyclin G2、Plk1的表达水平显著下调。同时,使用STI571抑制c-Abl的激酶活性,也能够显著下调Cyclin B1、Plk1和CENP-F等的转录水平和表达水平,说明c-Abl对FoxM1的调控能够显著影响其转录功能。进一步,我们探讨c-Abl对FoxM1的调控能否影响细胞周期进程。通过使用细胞周期同步化和流式细胞仪检测等技术方法,我们证实STI 571通过抑制c-Abl激酶活性,下调FoxM1的表达水平,并抑制其转录功能,进而抑制其靶基因蛋白Cyclin B1、Plk1和Aurora-B等的转录表达,最终导致细胞周期阻滞。FoxM1的另一个重要功能是参与肿瘤细胞的抗凋亡,为此,我们研究c-Abl对FoxM1的调控是否影响肿瘤细胞的凋亡。通过使用STI571和阿霉素(Doxorubicin,能够诱导肿瘤细胞凋亡)处理Hela细胞,检测凋亡蛋白Cleaved caspase3和Cleaved PARP-1的表达水平,发现STI571处理加剧了阿霉素诱导的Hela细胞凋亡,说明STI571通过抑制c-Abl激酶活性,下调FoxM1表达水平,抑制FoxM1的抗凋亡功能。我们的研究证实,c-Abl能够明显调控转录因子FoxM1,并且根据文献报道,c-Abl也能够调控其他的转录因子如c-Myc、NF-κB、C/EBPβ等。因此我们猜测,c-Abl/Arg能够参与调控基因的转录表达。为此,我们使用高通量测序(RNA-seq)和生物信息学分析的方法,对MCF-7WT及MCF-7 KD(c-abl/arg Knock-Down)细胞的RNA进行转录组分析。发现共有1034个基因的转录水平受到c-Abl/Arg的显著调控,c-abl/arg敲低之后,有635个基因的转录水平下调,399个基因的转录水平上调,说明c-Abl/Arg能够调控基因的转录水平,并且以正向调控为主。进一步,我们对受c-Abl/Arg调控的基因进行功能聚类分析,发现它们的功能参与多种信号通路和细胞代谢进程,并且这些通路和进程大多与已报道的c-Abl功能密切相关,提示c-Abl不仅在蛋白水平对相关功能通路进行调控,并且在基因转录水平也参与调控。综合以上研究结果,我们证实细胞内源性的c-Abl能够结合并磷酸化修饰FoxM1;c-Abl对FoxM1的磷酸化作用,抑制其经泛素-蛋白酶体途径降解,增强其稳定性,上调其表达水平;c-Abl对FoxM1的调控影响细胞周期进程和肿瘤细胞凋亡;c-Abl/Arg能够参与基因转录水平调控。本研究为深入探讨c-Abl和FoxM1的功能,特别是探讨两者在细胞周期进程和肿瘤细胞凋亡等方面的功能,提供重要的理论支撑。