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研究背景缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)常导致患者预后不良甚至死亡,是缺血性心脏病临床治疗效果不佳及心内直视手术后低心排发生的主要原因之一。外源性药物干预是对抗心肌IRI的重要策略,由于具体作用机制、药物来源、副作用和伦理学等诸多问题,至今仍未能获得理想的药物干预方法。因此寻找人体内源性抗心肌IRI的物质并探究其作用机制成为当前心肌保护方面的研究热点之一。褪黑素(melatonin)是松果体分泌的一种吲哚类激素,既往研究发现褪黑素对中枢神经节律有重要的调控作用,近期研究发现褪黑素对心血管系统的生理和病理同样具有明确的调节作用,还对心、脑、肝、肾、骨骼肌等多种器官的IRI有明显的保护作用,且没有外源性药物的毒性和致突变性,成为近年来抗心肌IRI研究领域的热点药物之一。有研究发现冠状动脉旁路移植术(CABG)后心肌IRI的程度与患者血浆中褪黑素的水平相关,褪黑素的含量高,心肌IRI的程度较轻。我们和他人前期研究发现褪黑素对心肌IRI和血管内皮细胞氧化应激损伤也有明确的保护作用。但褪黑素抗心肌IRI的机制尚未完全阐明,成为限制其进一步研究开发和临床广泛应用的瓶颈。蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3(JAK2/STAT3)信号通路是心血管系统发生、发育、病理和生理过程中基本信号通路之一。我们和他人研究发现JAK2/STAT3信号通路在缺血预处理、缺血后处理以及一些药物的心肌保护中发挥重要调控作用,并且国外学者研究发现褪黑素受体和JAK/STAT信号通路有着密切联系。实验目的:1.褪黑素预处理在离体心和心肌细胞水平是否有抗IRI作用。2.JAK2/STAT3信号通路是否参与介导褪黑素抗心肌IRI。3.褪黑素抗心肌IR诱导的线粒体氧化应激损伤是否与JAK2/STAT3信号通路有关。实验方法:一:在离体心水平研究褪黑素抗心肌IRI的作用及其机制。Ⅰ.褪黑素和AG490(JAK2/STAT3通路特异性阻断剂)对正常离体大鼠心脏的影响,成年健康雄性SD大鼠,随机分为3组,每组8只。1.对照(Control)组:离体心脏接受正常KH缓冲液持续灌注110 min(n=8);2.褪黑素(5μM)灌注组:离体心脏依次接受正常KH缓冲液加褪黑素(5μM)灌注5 min,然后正常KH缓冲液灌注105 min(n=8);3.AG490(2μM)灌注组:离体心脏依次接受正常KH缓冲液加AG490(2μM)灌注5 min,然后正常KH缓冲液灌注105 min(n=8);Ⅱ.褪黑素和AG490对大鼠离体心缺血再灌注损伤的影响,成年健康雄性SD大鼠,随机分为4组,每组8只。1.缺血再灌注(IR)组:正常KH缓冲液灌注5 min,停止灌注45min,再灌注60min。2.褪黑素加缺血再灌注(MEL+IR)组:正常KH缓冲液加MEL(5μM)灌注5 min,停止灌注45min,正常KH缓冲液再灌注60min。3.褪黑素加AG490加缺血再灌注(MEL+AG490+IR)组:正常KH缓冲液加MEL(5μM)和AG490(2μM)灌注5 min,停止灌注45min,正常KH缓冲液再灌注60min。4.AG490加缺血再灌注(AG490+IR)组:正常KH缓冲液加AG490(2μM)灌注5 min,停止灌注45min,正常KH缓冲液再灌注60min。采用离体大鼠心脏Langendorff逆行灌注模型,记录并分析灌流过程中心脏的血流动力学指标,包括心率(HR)、左室发展压(Left ventricular developed pressure,LVDP)、收缩期左室压力变化率最大值(The highest rate of change of pressure development,+dp/dtmax);收集灌流过程中冠脉循环流出液(Coronary effluent,CE),并测定1min内冠脉流量(Coronary flow,CF);酶联免疫吸附法测定CE中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的含量,以LDH的释放量反映心肌细胞坏死的程度;灌流结束后将心脏取下切片,三苯四唑氯盐(Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色,测定其心肌梗死面积;收集心脏标本,western blot分析p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax、cytosolic cytochrome c、SDH和COX等蛋白的表达情况。二:在心肌细胞水平研究褪黑素抗心肌IRI的作用及其机制。1-2天SD大鼠乳鼠作心肌原代培养,随机分为4组,每组8个复孔。1.模拟缺血再灌注(SIR)组:用正常含10%胎牛血清的DMEM培养液在细胞孵箱中培养心肌细胞26h后用缺血液处理2h,再用正常培养液处理4h。2.褪黑素加模拟缺血再灌注(MEL+SIR)组:用正常含10%胎牛血清的DMEM培养液在细胞孵箱中培养心肌细胞24h后用含MEL(2μM)的培养液处理2h,再用缺血液处理2h,然后用正常培养液处理4h。3.褪黑素加JAK2 si RNA加模拟缺血再灌注(MEL+JAK2 si RNA+SIR)组:用JAK2si RNA转染心肌细胞成功后,正常含10%胎牛血清的DMEM培养液加转染试剂培养心肌细胞24h后用含MEL(2μM)的培养液处理2h,再用缺血液处理2h,然后用正常培养液处理4h。4.JAK2 si RNA加模拟缺血再灌注(JAK2 si RNA+SIR)组:用JAK2 si RNA转染心肌细胞成功后,正常含10%胎牛血清的DMEM培养液加转染试剂培养心肌细胞24h后用正常的DMEM培养液处理2h,再用缺血液处理2h,然后用正常培养液处理4h。制作细胞爬片,TUNEL染色法测定原代心肌细胞凋亡率;收集细胞上清液,酶联免疫吸附法测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量,以LDH的释放量反映心肌细胞损伤的情况;通过Western blot检测原代心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax、cytosolic cytochrome c、SDH、COX、β-actin相关蛋白分子的表达情况。实验结果:1.褪黑素和AG490对正常离体大鼠心脏的影响开始分别用正常KH缓冲液加MEL(5μM)或AG490(2μM)灌流5 min,然后用正常KH缓冲液再灌注105min。在开始5min,MEL组和AG组与正常对照组相比,左室发展压(LVDP)明显下降(P<0.01)。然而当MEL(5μM)或AG490(2μM)移除后,用正常KH缓冲液再灌注时LVDP逐渐恢复到对照组的水平。MEL组和AG490组心肌梗死面积与对照组无明显差异。与对照组相比,MEL处理可以使p-JAK2和p-STAT3的表达明显上升(P<0.01);AG490处理可以使p-JAK2和p-STAT3的表达明显下降(P<0.01)。与对照组相比,MEL和AG490对t-JAK2和t-STAT3的表达无显著影响。2.褪黑素和AG490对大鼠离体心缺血再灌注损伤的影响与IR组相比,褪黑素可以改善缺血后心功能的恢复:可以明显提高离体心脏HR(IR,222.1±7.9;MEL+IR,251.6±7.5;P<0.01)、LVDP(IR,30.9±7.7;MEL+IR,56.4±7.5;P<0.01)、+d P/dt max(IR,607.0±101.0;MEL+IR,1173.0±89.0;P<0.01)和CF(IR,7.42±0.80;MEL+IR,9.82±0.78;P<0.01)。AG490可以减弱褪黑素的心肌保护作用。与MEL+IR组相比,MEL+AG490+IR组可以减弱缺血后心功能的恢复:可以明显降低离体心脏HR、LVDP、+d P/dt max和CF(P<0.01);可以增加心肌梗死面积(MEL+IR,10.25±3.44%;MEL+AG490+IR,35.64±4.08%;P<0.01)、心肌凋亡率(MEL+IR,15.18±3.41%;MEL+AG490+IR,42.06±3.50%;P<0.01)和LDH释放量(MEL+IR,36.88±4.72 IU/g;MEL+AG490+IR,72.45±4.37 IU/g;P<0.01)。3.褪黑素和AG490对大鼠离体心缺血再灌注后心肌线粒体的影响与IR组相比,MEL+IR组可以明显提高线粒体SOD活性(P<0.01);MEL+IR组可以明显降低线粒体丙二醛(Malonaldehyde,MDA)和H2O2的水平(P<0.01)。与MEL+IR组相比,MEL+AG490+IR组可以明显降低线粒体SOD活性(P<0.01);MEL+AG490+IR组可以明显提高线粒体MDA和H2O2的水平(P<0.01)。与IR组相比,MEL+IR组可以明显降低线粒体Eh。然而AG490可以减弱褪黑素的这种作用。4.褪黑素和AG490对大鼠离体心缺血再灌注后心肌JAK2/STAT3信号通路和凋亡相关信号通路的影响与IR组相比,MEL+IR组可以使p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、SDH和COX的表达水平显著升高(P<0.01);MEL+IR组可以使Bax和cytosolic cytochrome C的表达水平显著降低(P<0.01)。然而MEL+IR组中加入AG490可以逆转褪黑素的这些作用。与IR组相比,AG490+IR组可以明显下调p-JAK2和p-STAT3的表达水平;然而AG490+IR组对t-JAK2和t-STAT3的表达水平没有明显影响。5.褪黑素和JAK2 si RNA对乳鼠原代心肌细胞模拟缺血再灌注损伤的影响与SIR组相比,MEL+SIR组可以明显提高心肌细胞活力(P<0.01)。在显微镜下观察,与SIR组相比,MEL+SIR组可以明显提高心肌细胞的收缩能力和粘附能力。TUNEL免疫荧光染色显示:与SIR组相比,MEL+SIR组可以明显降低心肌细胞凋亡率(P<0.01)。然而与MEL+SIR组相比,JAK2 si RNA可以逆转褪黑素的这些作用(P<0.01)。与SIR组相比,MEL+SIR组可以明显降低细胞培养液中LDH的释放量和线粒体MDA水平(P<0.01)。另外,与SIR组相比,MEL+SIR组可以明显提高线粒体SOD活性。然而与MEL+SIR组相比,JAK2 si RNA可以逆转褪黑素的这些作用(P<0.01)。与SIR组相比,MEL+SIR组可以使心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、SDH和COX的表达水平显著升高(P<0.01);MEL+SIR组可以使Bax和cytosolic cytochrome C的表达水平显著降低(P<0.01)。然而与MEL+SIR组相比,JAK2 si RNA可以逆转褪黑素的这些作用(P<0.01)。与SIR组相比,JAK2 si RNA+SIR组可以明显下调p-JAK2、t-JAK2和p-STAT3、t-STAT3的表达水平(P<0.01)。实验结论:褪黑素通过激活JAK2/STAT3信号通路,进一步减轻线粒体氧化应激损伤和细胞凋亡,从而发挥抗心肌IRI的作用。