草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）属于水生呼肠孤病毒属,是水生呼肠孤病毒属中危害最大的病原之一,也是中国分离的第一株水生动物病毒,可感染草鱼和青鱼,严重时造成80%-100%的死亡率。稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是一种小型的实验鱼类,研究证明稀有鮈鲫对部分草鱼呼肠孤病毒株很敏感,感染GCRV后,鱼体会表现出明显的出血病症状,甚至死亡。草鱼出血病流行病学调查显示,目前国内有三种基因型GCRV,基因II型为主要流行株型,GCRV-Ⅱ型毒株存在不能产生细胞病变,病毒增殖量低,常用草鱼细胞携带病毒等问题,亟需建立无病原携带且对GCRV-Ⅱ敏感的细胞系进行GCRV-Ⅱ型病毒致病机制、疫苗研发研究。本研究主要包括两部分内容:1.稀有鮈鲫卵细胞系的建立:本文采用胰蛋白酶消化法进行稀有鮈鲫卵组织的体外培养,并通过对培养液配方条件的优化成功地进行了稀有鮈鲫卵细胞的原代培养和继代培养,该细胞命名为GrE（Gobiocypris rarus eggs,GrE）。结果显示,GrE细胞的较适宜培养液为含有10%胎牛血清（FBS）的M199培养液,较适宜培养温度为28℃。细胞的贴壁、生长和分裂状态良好,GrE细胞为典型的上皮样细胞;经连续继代培养后,已成功建立了稀有鮈鲫卵细胞系,现已继代培养至第70代;染色体分析结果显示,GrE染色体众数为2n=66,核型为2n=30m+24sm+10t+2st,而稀有鮈鲫鱼体的染色体数目为2n=50,GrE细胞的染色体数目已发生改变,表明GrE细胞已发生突变,为永生化细胞系。GrE细胞系细胞经液氮冻存复苏后仍保持其原有细胞形态,其贴壁生长状态和增殖速度也与冻存前无差异。2.稀有鮈鲫卵细胞的应用:（1）将特定浓度的不同水生动物病毒,包括I、II型草鱼呼肠孤病毒（GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）、大口黑鲈虹彩病毒（LMBV）,蛙虹彩病毒（FV3）)等接种至稀有鮈鲫卵细胞,接种后观察细胞产生细胞病变（CPE）情况,并用PCR进行定性检测。结果显示,GrE接种这五种病毒后,除接种GCRV的细胞外,其余细胞内均出现明显的CPE,且RT-PCR/PCR均检测出特异性目的条带,说明GrE细胞可用于上述常见病毒的分离和鉴定。此外,对于未产生明显CPE的GCRV接种组,通过间接免疫荧光进一步验证GrE细胞对GCRV-Ⅰ和GCRV-Ⅱ的敏感性,两种基因型的GCRV的滴度分别为10⁵.59.59 TCID₅₀/ml、10⁶.47.47 TCID₅₀/ml。（2）本研究进一步比较了GrE和草鱼肾脏细胞CIK对GCRV的敏感性,将初始滴度为10³ TCID₅₀/ml的GCRV-Ⅰ和GCRV-Ⅱ同时接种于GrE和CIK细胞,GCRV-Ⅰ感染实验共7d,GCRV-Ⅱ感染实验14d,计算两种不同基因型GCRV在GrE和CIK细胞中的病毒拷贝数。结果显示,在GrE和CIK两种细胞中,GCRV-Ⅰ型的最高病毒拷贝数出现在第4 d,分别为1.45×10⁵拷贝/μL（GrE）、1.26×10⁴拷贝/μL（CIK）,而GCRV-Ⅱ病毒拷贝数分别在感染CIK 7 d（约3.37×10⁴拷贝/μL）和GrE 12 d（约2.25×10⁵拷贝/μL）后达到高峰。（3）将GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ分别感染GrE细胞并传代20代,第1代和20代GCRV-Ⅰ都未能使稀有鮈鲫出现任何出血病的临床症状,组织病理切片结果显示,与阴性对照组无明显区别。前后两个代次的GCRV-Ⅱ注射感染稀有鮈鲫3-5d,鱼体出现了典型的出血病临床症状。鱼体各组织出现比较明显的病理变化,其中脑和肝组织的细胞间隙变大,有的细胞出现破裂,脾脏和肾脏组织中出现明显的棕黄色噬铁血红素中心,肠道毛细血管出血严重并伴随有肠绒毛破碎、形状不完整的现象。本研究成功构建稀有鮈鲫卵细胞系GrE,确定了细胞系的较适宜生长条件,并对细胞系的生长特性、细胞形态、染色体形态及在水生动物病毒上的应用进行了初步研究,研究结果表明,GrE可用于多种常规水生动物病毒的分离和培养。GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ均可以在GrE中增殖,与草鱼肾脏细胞CIK相比,GrE更适合GCRV-Ⅱ的增殖。两种基因型GCRV感染稀有鮈鲫后,通过临床症状观察,组织病毒载量测定,组织病理分析,表明GCRV-Ⅱ在GrE细胞上传代,至少20代毒力保持稳定。本研究中建立的GrE细胞可以用于流行基因型草鱼呼肠孤病毒的流行病学、致病机理、以及疫苗研发等相关研究。