论文部分内容阅读
第一部分DLL3在小细胞肺癌肿瘤组织中的表达及其意义目的:检测DLL3蛋白在小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)肿瘤组织中的表达情况,探讨DLL3的表达与SCLC患者临床病理参数、化疗敏感性及预后之间的关系。方法:1.按照入组标准筛选入组SCLC患者,收集其临床信息;2.采用免疫组化方法检测SCLC患者组织标本中DLL3的表达情况,将患者分为高表达组和低表达组;3.统计分析DLL3表达与临床病理特征及含铂方案化疗敏感性的关系;KaplanMeier分析DLL3表达与晚期SCLC患者无进展生存期(Progression-Free Survival,PFS)和总生存期(Overall Survival,OS)之间的关系。结果:1.72例患者纳入此项临床研究。DLL3在SCLC肿瘤组织中的阳性表达率为79.17%(57/72),主要定位于细胞膜。DLL3表达量与患者年龄、性别、吸烟史、TNM分期、肿瘤直径均无统计学相关性(P>0.05);2.DLL3低表达组化疗有效率(RR)高于高表达组,两组之间的差异具有统计学意义(p=0.041)。疾病控制率(DCR)在两组之间无明显统计学差异(56.5%VS77.6%,p=0.095)。DLL3低表达组中位PFS为6.8个月,DLL3高表达组中位PFS为4.9个月,两组差异具有统计学意义(P<0.05),但OS在两组之间无统计学差异(P=0.866)。结论:1.DLL3在晚期SCLC组织中高表达,在正常肺组织中无表达。DLL3主要定位于细胞膜。DLL3表达水平与性别、年龄、吸烟史、TNM分期、肿瘤直径无相关性。2.DLL3表达与晚期SCLC患者化疗反应率和PFS呈负相关,DLL3可能是预测晚期SCLC患者化疗敏感性的生物学标志物。第二部分DLL3对小细胞肺癌H69和H20细胞株增殖侵袭的影响目的:探究DLL3在SCLC细胞增殖、侵袭中的作用。方法:1.q RT-PCR法检测DLL3 m RNA在5种SCLC细胞株(H2227,H446,H524,H69和H20)及正常肺上皮细胞(HBE)中的相对表达情况;2.转染sh-RNA使DLL3基因沉默或表达下调;3.CCK8、Edu增殖实验检测SCLC细胞株H69和H20在沉默DLL3基因后的增殖情况;4.Transwell小室检测SCLC细胞株H69和H20在沉默DLL3基因后的侵袭和转移能力的变化。5.Western blot、免疫荧光检测SCLC H69和H20细胞株沉默DLL3基因后NCadherin和E-Cadherin的表达情况。结果:1.q PCR结果显示DLL3m RNA在5种SCLC细胞株中的表达均高于支气管上皮细胞,其中在H69和H20细胞株中DLL3m RNA表达水平最高;2.SCLC细胞株H69和H20转染sh-DLL3#1,sh-DLL3#2,sh-DLL3#3后,相对于对照组sh-DLL3-NC,DLL3 m RNA表达明显下降,其中以sh-DLL3#2沉默作用最为显著。3.CCK-8、Ed U细胞增殖实验结果示沉默DLL3基因后,SCLC细胞株H69和H20的增殖受到抑制(P<0.001);4.Transwell小室结果示沉默DLL3基因后,SCLC细胞株H69和H20的侵袭能力下降。5.Westernblot、免疫荧光结果示沉默DLL3基因后,EMT相关蛋白E-cadherin表达增强,N-cadherin蛋白表达降低,表明EMT受到抑制。结论:DLL3促进SCLC细胞增殖、侵袭及EMT进展。第三部分DLL3在小细胞肺癌恶性行为中的机制研究目的:探究mi R-518d-5p和LIN28B对DLL3的调控作用以及对小细胞肺癌细胞株恶性生物学行为的影响。方法:1.通过生物信息学预测与DLL3m RNA结合的RNA结合蛋白、mi RNA及结合位点(http://starbase.sysu.edu.cn/);2.共转染mi R-518d-5p和DLL3 m RNA 3’UTR结合靶点载体(DLL3-WT)、突变体(DLL3-MUT)以及LIN28B m RNA 3’UTR结合靶点载体(LIN28B-WT)以及突变体(LIN28B-MUT),双荧光素酶报告基因实验、Ago2-RIP验证mi R-518d-5p与DLL3和LIN28B3’UTR的直接结合;3.转染mi R-518d-5p mimics,检测DLL3 m RNA、LIN28B m RNA及其蛋白表达水平的变化情况;4.共转染sh-DLL3和LIN28B过表达载体,检测小细胞肺癌H69、H20细胞株增殖、转移和侵袭能力及N-Cadherin和E-Cadherin蛋白水平变化情况;5.共转染sh-DLL3和过表达LIN28B载体、共转染sh-DLL3和mi R-518d-5p inhibitor,检测小细胞肺癌H69、H20细胞株增殖、转移和侵袭能力及N-Cadherin和E-Cadherin蛋白水平变化情况。结果:1.Starbase数据库示LIN28B是与DLL3结合的RNA结合蛋白,RIP实验结果证实LIN28B与DLL3相互作用,下调LIN28B导致DLL3 m RNA稳定性下降,降解速度加快。2.生物信息学预测到mi R-518d-5p和LIN28B m RNA 3’UTR、DLL3 m RNA 3’UTR有潜在的结合位点。3.Ago2-RIP示mi R-518d-5p、LIN28B及DLL3均可以与AGO2蛋白相互作用。进一步双荧光素酶报告基因实验果示共转染mi R-518d-5p mimics和DLL3 3’UTR后,荧光素酶活性明显下降(P<0.001);而在mi R-518d-5p结合位点突变组荧光素酶活性无明显改变(P>0.05)(图3-6左,P<0.001);同样地,共转染mi R-518d-5p mimics和LIN28B 3’UTR后,荧光素酶活性明显下降(图3-6右,P<0.001);而在mi R-518d-5p结合位点突变组荧光素酶活性无明显改变(P>0.05)。4.转染mi R-518d-5p mimics后,H69和H20细胞株LIN28B、DLL3表达在基因及蛋白水平表达均明显降低(P<0.001);5.转染mi R-518d-5p inhibitor或LIN28B过表达载体后,H69和H20细胞株增殖能力、转移能力和侵袭能力均增强,E-Cadherin蛋白表达降低,N-Cadherin蛋白表达增高,并可部分恢复sh-DLL3转染细胞的增殖及侵袭能力(P<0.05)。结论:mi R-518d 5p可以靶向LIN28B稳定的DLL3负向调控SCLC细胞恶性生物学行为。