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强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，AS)是一种严重危害人类身体健康和生存质量，并严重影响劳动力的慢性全身性自身免疫性疾病，其起病隐匿，病程长，最终导致患者丧失活动能力，甚至致残。迄今AS的病因尚不不清楚，其发病机制并不明确，目前无任何特异性治疗方法，因此有关AS治疗策略的探索始终是国内外研究尤为关注的焦点、热点和难点。目前所使用药物与方案仍以非特异性缓解对症疗法为主，这会产生多种多样的毒副作用。因此，如何研创出高效、低毒、特异的新型药物，使其既能迅速缓解AS的症状，又能地选择性有效阻断AS的病理过程已成为风湿免疫学领域亟待解决的关键问题！从理论上讲，任何能够有效减少、抑制或阻断AS病理生理发生与发展进程的药物都能有效减轻或缓解AS的骨关节病变。鉴于HLA-B27是AS发生发展的免疫过程的中心环节，选择性阻断HLA-B27信号途径就成为有效治疗AS自身免疫性疾病的重要策略之一。所以本课题拟将免疫阻断与基因治疗性疫苗两大策略进行有机结合，创新性研制出基于阻断HLA-B27信号途径的全新治疗性基因疫苗。本研究在前期工作中采用HLA-B*2704及HLA-B*2705重链胞外区蛋白筛选噬菌体12肽随机肽库并获得了能与其特异性结合的拮抗肽（antagonist peptide，AP）。本研究的主要目的是对筛选得到的AS治疗性疫苗：HLA-B*2705-AP进行真核表达载体的构建、体外表达鉴定，并对其生物学活性进行初步研究。本研究首先对HLA-B*2705-AP进行了pcDNA3.1真核表达载体的构建和表达鉴定，并对其生物学活性进行了初步研究。但是，由于HLA-B27拮抗肽分子量特别小，不利于体外实验鉴定与观察，所以本研究又进一步构建了融合有增强型绿色荧光蛋白编码基因的pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表达载体和pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合表达载体。通过系列研究获得如下研究结果：第一部分：pcDNA3.1/B*2705-AP真核表达载体的构建、表达及其生物学活性的初步研究1.通过PCR的方法得到了HLA-B*2705-AP基因，确定了所用的PCR条件为：98℃预变性5分钟后；98℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸30秒，共30个循环；循环结束后再72℃延伸8分钟，最后于4℃保存。PCR得到目的基因为122bp。2.得到的HLA-B*2705-AP基因通过T4连接酶连接到pMD18-T载体后在大肠杆菌Top10进行克隆，并且菌落PCR和测序结果表明目的基因已经连接到载体中。3.得到的pMD18-T/HLA-B*2705-AP载体和pcDNA3.1（+）载体经过KpnⅠ和XbaⅠ双酶切，构建pcDNA3.1（+）/HLA-B*2705-AP重组载体载体后在大肠杆菌Top10进行克隆，并且菌落PCR和测序结果表明目的基因已经连接到载体中。4.将重组表达载体pcDNA3.1（+）/HLA-B*2705-AP转染cos7细胞，重组表达载体通过GenFectin介导方法转到真核细胞中，进行表达。通过RT-PCR的方法检测转染的真核细胞中B*2705拮抗肽-蛋白的表达，电泳结果表明转染真核表达载体的细胞在100bp处可见特异性条带，而未转染的细胞没有该条带。5.通过补体依赖性HLA-B27阳性淋巴细胞的细胞毒的试验发现，所转染的真核细胞的上清可以有效阻断特异性HLA-B27的杀伤作用。第二部分:pcDNA3.1/B*2705/2704-AP-EGFP融合基因真核表达载体的构建、表达及其生物学活性的1.初步研究通过PCR的方法得到了HLA-B*2705-AP及HLA-B*2704-AP基因，确定了所用的PCR条件为：98℃预变性5分钟后；98℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸30秒，共30个循环；循环结束后再72℃延伸8分钟，最后于4℃保存。PCR得到目的基因为122bp.。2.得到的HLA-B*2705-AP及HLA-B*2704-AP基因片段和pcDNA3.1（+）-EGFP载体经过KpnⅠ和XbaⅠ双酶切，分别构建pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP以及pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表达载体，并在大肠杆菌Top10进行克隆，经菌落PCR和测序结果表明目的基因已经连接到载体中。3.将重组表达载体pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP和pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表达载体分别转染CHO细胞，重组表达载体通过GenFectin介导方法转到真核细胞中并进行表达。在荧光显微镜下可以清晰地看到在细胞中所表达的绿色荧光蛋白，经流式结果表明荧光细胞占总细胞的比例分别是64.86％和57.91％，表明转染效率较高。4.通过RT-PCR的方法检测转染的真核细胞中B*2705-AP-EGFP及B*2704-AP-EGFP蛋白的表达，转染真核表达载体的细胞在1000bp处可见特异性条带（测序引物CMV-f和BGH-r），而转染空载体的细胞未出现此条带，这说明该细胞已整合了该融合蛋白的mRNA。5.采用WesternBlot方法检测转染后细胞表达融合蛋白的抗原性。结果表明转染重组载体的细胞在相对分子质量约30KD处有阳性条带，而空载体转染细胞无任何条带显示。6.在抗HLA-B27抗血清介导的补体依赖性HLA-B27阳性淋巴细胞的细胞毒的实验中，100%的细胞死亡。若向此实验体系中加入5μl转染重组质粒B*2705-AP-EGFP及B*2704-AP-EGFP的细胞破碎的上清，分别有50%和40%的细胞毒反应被阻断，说明表达的重组蛋白有特异性阻断B27反应的能力。7.荧光显微镜分别检测拮抗肽与细胞的结合情况，B*2705-AP-EGFP和B*2704-AP-EGFP与正常HLA-B27阴性B细胞不结合,而可分别与HLA-B*2705及B*2704阳性细胞株结合，表明这种结合具有特异性，同时用流式细胞术检测的方法更进一步的证明了结合的特异性。综上所述，本研究成功构建了HLA-B*2705拮抗肽的真核表达载体，并通过基因转录、蛋白表达、特异性检验以及生物学活性的初步研究，为HLA-B27拮抗肽在AS治疗性核酸药物中的深入研究提供了较坚实的实验数据和理论支持。