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目的研究山荷叶素糖苷类化合物对V-ATPase活力的影响,探讨其对人乳腺癌细胞侵袭及迁移的作用及机制。方法1)化合物活性筛选:Wound healing实验(划痕实验)观察山荷叶素糖苷类化合物对人乳腺癌细胞MCF-7迁移的影响;V-ATPase试剂盒检测山荷叶素糖苷类化合物对MCF-7细胞V-ATPase活力的影响。2)目标化合物(mj-9e)的细胞毒性研究及对乳腺癌细胞V-ATPase的影响:MTT法检测肿瘤细胞及正常细胞的活力;台盼蓝染色法检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;V-ATPase试剂盒检测V-ATPase的活力;溶酶体荧光探针LysoTracker染色检测细胞溶酶体内pH;荧光探针BCECF-AM检测细胞胞质pH。3)mj-9e对乳腺癌细胞侵袭及迁移的影响:Wound healing实验观察细胞的迁移;Transwell实验反映细胞的侵袭;Western blot检测MMPs的表达;明胶酶谱法检测MMP-2及MMP-9的活化。4)mj-9e对乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响:Western blot检测β-catenin的表达;免疫荧光观察mj-9e对β-catenin胞内分布及表达的影响;RT-PCR(逆转录PCR)检测β-catenin及下游靶基因Cyclin D1、MMP-2、c-myc的转录水平;分别采用蛋白酶抑制剂MG132及蛋白合成抑制剂CHX处理细胞后观察β-catenin蛋白的表达。5)GSK3β在mj-9e抑制β-catenin通路中的作用:Western blot检测p-GSK3β的表达;采用GSK3β抑制剂LiCl处理细胞后,研究mj-9e对Wnt/β-catenin信号通路的影响,包括Western blot检测β-catenin表达变化,免疫荧光检测β-catenin胞内分布及表达的影响,Wound healing实验检测细胞的迁移能力,Transwell实验检测细胞的侵袭能力,Western blot检测MMP-2蛋白的表达变化。结果1)在合成的8种山荷叶素天然糖苷类化合物中,mj-9e对乳腺癌细胞的迁移能力及V-ATPase活力抑制作用最强,因此选取mj-9e作为目标化合物,探讨其抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的作用与机制。2)mj-9e(0.1~1μM)作用24 h后对MCF-7细胞的增殖有明显的抑制作用,但不会诱导细胞凋亡,同时对正常人胚胎肝细胞WRL68活力无明显影响。mj-9e可以抑制乳腺癌细胞V-ATPase活力且具有浓度依赖性,与同浓度的Baf A1抑制作用相当;mj-9e能够降低MCF-7细胞胞质内pH,增加溶酶体内的pH。3)mj-9e对低侵袭性乳腺癌细胞(MCF-7)及高侵袭性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的侵袭及迁移能力均有抑制作用且具有浓度依赖性,与同浓度的Baf A1抑制作用相当;mj-9e可以抑制乳腺癌细胞MMP-2及MMP-9的表达与活化。4)mj-9e可以抑制MDA-MB-231细胞β-catenin蛋白的表达以及核转位;显著抑制其下游靶基因Cyclin D1及MMP-2的转录;mj-9e可能促进MDA-MB-231细胞β-catenin的泛素化降解。5)mj-9e可以降低MDA-MB-231细胞p-GSK3β的表达。GSK3β活性抑制剂LiCl单独处理24 h后,p-GSK3β表达显著升高;当LiCl与mj-9e共同作用时p-GSK3β及β-catenin表达上调,β-catenin发生核转位,提示通过LiCl抑制GSK3β激酶活性可逆转mj-9e对β-catenin的抑制作用;通过Wound healing实验、Transwell实验、Western blot进一步证明mj-9e是通过降低GSK3β激酶活性抑制β-catenin通路,从而实现对人乳腺癌细胞的侵袭及迁移的抑制作用。结论山荷叶素天然糖苷类化合物mj-9e可以较强地抑制乳腺癌细胞的V-ATPase活力,通过GSK3β抑制β-catenin通路从而实现对乳腺癌细胞的侵袭及迁移的抑制作用。