B7分子(包括B7-1和B7-2，又称CD80和CD86)是表达在APC表面的共刺激分子，其与表达于T细胞表面的相应受体CD28/CTLA-4结合产生共刺激信号，对T细胞的活化和耐受起关键性调节作用。CD86为一个由1120bp的基因所编码，其基因序列与B7-1有26％的同源性，整个蛋白由306个氨基酸组成，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白。本研究在已获得稳定分泌鼠抗人CD86单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上，采用基因重组技术及细胞与分子生物学方法等进行了以下研究： 1.CD86人-鼠嵌合抗体表达载体的构建及在CHO细胞中的表达 首先采用RT-PCR从特异性分泌抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D1中提取总RNA，常规逆转录，应用简并引物进行PCR扩增，并根据重、轻链基因序列分析结果设计引物，应用SMART-PCR方法扩增含信号肽序列的VH和VL基因，进行测序鉴定。在本科室构建的表达质粒PIRES/ch5C11基础上，通过PCR获得人IgGl Y链、κ链恒定区基因。将含信号肽序列的VH序列和人的IgGl重链恒定区序列进行拼接获得嵌合重链，将含信号肽序列的VL序列和人的κ链恒定区序列进行拼接获得嵌合轻链，拼接产物测序鉴定，构建共表达嵌合重、轻链的重组质粒pIRES/ch1D1。采用脂质体法将重组质粒转染293T细胞。以CD86-L929基因转染细胞株作为检测细胞，经流式细胞术对293T细胞培养上清鉴定后转染CHO细胞，再行鉴定后大量收集无血清培养上清，经Protein G亲和层析纯化及Lowry法定量。结果显示，本研究成功构建了含人-鼠嵌合重链和嵌合轻链基因的CD86人-鼠嵌合抗体真核表达载体pIRES/ch1D1。选择中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达宿主，经试剂盒抽提的pIRES/ch1D1嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞，经G418加压筛选后进行亚克隆，获得持续稳定分泌抗人CD86人-鼠嵌合抗体(ch1D1)的基因转染细胞株(ch1D1-CHO)。RT-PCR鉴定结果表明ch1D1表达基因成功整合在ch1D1-CHO细胞中；FCM结果表明，转染plRES/ch1D1质粒的CHO培养上清中的嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞膜型CD86分子的阳性结合率为98.5％。从CHO细胞培养上清中获取嵌合抗体纯化品的量约为3.0m/L。 2.CD86人-鼠嵌合抗体的生物学活性的初步研究 采用间接免疫荧光及流式细胞术方法，对多株肿瘤细胞株Daudi、Sub-T、U937、Jurkat、HO8910、H1299及WERI-RB1细胞膜性CD86分子进行分析。在此基础上，选取天然高表达CD86及CD80分子的Daudi细胞为靶细胞，观察和分析了抗CD86嵌合抗体单独及联合抗CD80嵌合抗体对细胞生长和增殖的影响作用。将嵌合抗体(终浓度为5μ/mL)加入到Daudi细胞的培养体系中，经显微镜观察及MTT法分析，嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(p<0.05)，且CD86与CD80嵌合抗体具有协同抑制作用。将两个健康人外周血单个核细胞(PBMC)加入96孔板中，分别加入CD86嵌合抗体及联合CD80嵌合抗体(终浓度为5μg/mL,于培养72小时采用MTT法检测增殖情况。结果显示在双向混合淋巴细胞反应中，CD86嵌合抗体能抑制混合淋巴细胞的增殖效应，且CD86与CD80嵌合抗体具有协同抑制作用。 综上所述，本实验成功构建了CD86人-鼠嵌合抗体(chlDl)真核表达质粒，并在CHO细胞中实现了稳定表达，表达的嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Daudi细胞的生长增殖具有抑制作用，并且在混合淋巴细胞反应中，能抑制混合淋巴细胞的增殖效应。