【摘 要】
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小檗碱桥状酶（BBL,berberine bridge enzyme-like）在烟碱生物合成的最后一步起到关键催化作用。为了开展烟草BBL基因的功能研究和新种质的创制,本研究从小基因家族BBL基因家族中选取三个目标基因BBLa、BBLc、BBLd,采用PCR技术从烟草中分离出BBLa、BBLc、BBLd的c DNA全长,分别构建过表达载体PSH-CAM-BBLa、PSH-CAM-BBLc和PSH
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小檗碱桥状酶（BBL,berberine bridge enzyme-like）在烟碱生物合成的最后一步起到关键催化作用。为了开展烟草BBL基因的功能研究和新种质的创制,本研究从小基因家族BBL基因家族中选取三个目标基因BBLa、BBLc、BBLd,采用PCR技术从烟草中分离出BBLa、BBLc、BBLd的c DNA全长,分别构建过表达载体PSH-CAM-BBLa、PSH-CAM-BBLc和PSH-CAM-BBLd;再根据NCBI上公布的BBL基因CDS序列,在其外显子上设计靶点,分别合成Oligo二聚体然后和CRISPR载体连接,转大肠杆菌至感受态提取质粒测序,将测序结果符合预期的质粒用内切酶切割后用T4连接酶重组连接,成功构建了CRISPR/Cas9敲除载体。利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染法来转化烟草,在潮霉素B（Hygromycin B）筛选培养基中浓度高于10 mg/L会抑制外植体的分化,当浓度为5 mg/L时效果较好。经过GUS染色以及PCR检测获得过表达阳性株42株,阳性率为35%;敲除阳性株为21株,阳性率为23.3%。经表型观察发现过表达T0代植株株高出现不同程度的增高,叶面积增大,出现了一定程度的变异,敲除植株也类似,对烟株的影响较小,均不影响烟草的正常生长。RT-q PCR分析发现过表达突变株叶中BBL表达量显著上升;在敲除植株中BBL表达量显著降低,表明载体已经成功导入烟株中。通过HPLC测定阳性株烟叶中烟碱含量,发现过表达植株烟碱含量不同程度地增加,其中BBLc过表达植株增加效果最明显;而敲除植株烟碱含量不同程度地降低,其中BBLa敲除植株下降效果最明显,表明BBL基因参与了烟碱的合成,为后续深入研究BBL作用机理以及为充分探明吡啶环和一个吡咯烷环结合提供了参考,以及为培育较高尼古丁或低尼古丁含量的烟草新新品系奠定基础。
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