论文部分内容阅读
聚乙烯亚胺(PEI)是最具代表的人工合成阳离子聚合物之一，由于其电荷密度较高，质子缓冲能力强，已被广泛用作基因转染的载体。高分子量的PEI具有较高的基因转染效率，但细胞毒性大、生物相容性差，这些缺点限制了它在临床上的应用；而低分子量的PEI的毒性虽小，但转染能力弱，通过交联或大分子接枝使其电荷密度增加，可提高其基因转染效率。两性离子化合物由于静电水化作用具有超亲水性，能抑制蛋白的非特异性结合。本工作结合低分子量PEI的低毒性和两性盐的生物相容性等优点，采用几种新方法对低分子量PEI进行了改性，获得了几种低毒性和较高转染效率的基因载体，并重点考察了载体与DNA的复合能力、质子缓冲能力、生物相容性、细胞毒性和体外转染效率。本论文的研究内容主要分为以下几个方面。(1)制备了含对pH值敏感的腙键的交联剂(Hdz)，使之经酰胺化反应来交联低分子量PEI (PEI1.8K)，并采用Michael加成将含C＝C的磺酸基甜菜碱化合物(DMAAPS)接枝到交联的PEI上，得到了三种基于交联PEI的聚合物基因载体(PEI-Hdz-DMAAPS)，并采用1H NMR对其结构进行了表征。采用粘度法考察了样品在两种pH下的粘均分子量，结果表明在pH=7.4时，改性PEI的分子量较大；而在pH=5.0时由于腙键断裂，交联被破坏，聚合物分子量迅速下降。酸碱滴定实验结果表明，聚合物基因载体在pH=5~7之间存在一个缓冲区，说明载体具有一定的质子缓冲能力。采用凝胶电泳和光散射法考察了载体与DNA的结合能力，结果表明，所合成的载体能与DNA很好地形成复合物，且光散射证实复合物粒径在200~400nm。溶血实验结果表明，甜菜碱修饰的载体几乎没有溶血效应。蛋白吸附实验结果表明，甜菜碱修饰的载体蛋白吸附能力远低于阳性对照PEI25K(分子量为25000的PEI)。MTT实验结果表明，在HeLa和293T细胞中，交联后的PEI毒性低于PEI25K，而经甜菜碱进一步改性后载体的毒性更低。体外转染实验显示，PEI-Hdz-DMAAPS21.2%和PEI-Hdz-DMAAPS36.0%两种样品能有效介导基因转染。这两种载体在HeLa和293T两种细胞中，转染效率高于PEI25K，且在含10%血清的培养基中仍能保持较高的转染效率。(2)采用腺嘌呤(Adenine，A)对PEI1.8K进行了修饰，并通过两端带有尿嘧啶(Uracil，U)的交联剂对修饰后的样品进行交联，且用甜菜碱(Betaine，B)进一步修饰了PEI，获得了两种聚合物基因载体(PEI-A-U-U和PEI-A-B-U-U)。采用1H NMR对它们的结构进行了表征。用粘度法考察了样品的粘均分子量，结果表明在pH=7.4时，交联的载体表现出较大的分子量；而在pH=5.0时由于氢键被破坏，聚合物分子量明显下降。采用变温红外光谱证明了氢健的存在。酸碱滴定实验结果表明，载体在pH=5~7之间具有一定的质子缓冲能力。采用凝胶电泳考察了载体与DNA的结合能力，结果表明，交联的载体均能与DNA很好地形成复合物，且光散射结果表明复合物的粒径约为200nm。溶血实验结果表明，PEI-A-B-U-U几乎没有溶血效应。蛋白吸附实验结果表明，甜菜碱修饰的载体蛋白吸附能力远低于PEI25K。MTT实验结果显示，在HeLa和293T细胞中，交联后的PEI毒性低于PEI25K，甜菜碱进一步改性后的载体毒性更低。体外转染实验结果表明，PEI-A2.3-U-U和PEI-A2.3-B2.1-U-U在无血清条件下，在HeLa和293T两种细胞中均能有效介导基因转染，且转染效率明显高于PEI25K。PEI-A2.3-B2.1-U-U在10%血清培养基中转染仍能保持较高的转染效率，具有良好的耐血清能力。(3)采用葡聚糖40K(Dex)接枝低分子量PEI (PEI600Da)，并进用甜菜碱来改性上述接枝物，得到Dex-PEI-B系列聚合物基因载体。采用1H NMR对其结构进行了表征。采用凝胶电泳和光散射考察了载体与DNA的结合能力，结果表明，交联的载体均能与DNA很好地形成复合物，且粒径为300~400nm。溶血实验表明，所合成的载体均没有溶血性能。蛋白吸附实验结果表明，葡聚糖改性能在一定程度上降低蛋白吸附量，后续的甜菜碱改性能进一步减少蛋白吸附。MTT实验表明，四种Dex-PEI系列载体均表现出极低的毒性。体外基因转染实验表明Dex-PEI16与Dex-PEI16-B22在无血清条件下，在HeLa和293T细胞中能有效介导基因转染，且转染效率与PEI25K相当。在有血清培养基中，Dex-PEI16-B22仍能保持良好的转染效率，表现出优良的血清耐受能力。综上所述，本研究所合成的几种基于低分子量PEI并被甜菜碱修饰的聚合物基因载体，既具有优良的生物相容性和低细胞毒性，又具有较高的基因转染效率，特别是在有血清条件下仍能保持良好的转染效率，因此，这类载体有望成为安全高效的新型基因载体。