论文部分内容阅读
【目的】半乳甘露聚糖(galactomannan,简称GM)存在于曲霉菌胞壁，且在曲霉菌生长过程中会释放至外液。GM已作为诊断侵袭性曲霉菌感染的标志物，而现有的检测方法存在诸多局限性，本研究目的从烟曲霉菌中提取纯度高、分子量均一的GM，为进一步建立基于GM检测的侵袭性曲霉菌感染诊断新技术奠定基础。【方法】1.选取温度为A因素、通气量为B因素、接种量为C因素，各取3个水平，以菌体生成量和胞外多糖产量为指标进行正交实验，通过分析选取最优培养条件。2.收集烟曲霉发酵液，通过浓缩、醇沉、抽滤、透析、冻干等步骤得到粗多糖，再将粗多糖行去蛋白、过柱等纯化步骤处理，得到多糖P1；采用碱裂解菌丝体，经过离心、浓缩、透析、冻干等步骤得到粗多糖，经conA sepharose4B亲和层析填料纯化，加入葡聚糖酶，得到多糖P2。3.采用TOSOH TSK gel3000PWxl柱子，分析多糖的纯度；高效凝胶色谱法测定标准品右旋糖酐分子量，并制成标准曲线，计算出待测多糖分子量。4.用三氟乙酸催化多糖水解成单糖，采用硅胶薄层层析法初步分析多糖的单糖组分；继而用三甲基硅咪唑和醋酸酐将单糖衍生化，使之成为易挥发、对热稳定的衍生物，采用气相色谱法进一步分析单糖的种类和比例。【结果】1.通过正交试验分析，培养温度28℃、通气量150ml，接种量为5%时，曲霉菌的生长状态最好，得到的胞外多糖量和菌丝体量分别为初始条件的1.151倍和1.273倍。2.经过一系列纯化步骤，得到1.58g的胞外多糖P1，纯度达94.7%；162.7mg胞内多糖P2，纯度为96.0%；高效凝胶色谱法分析，胞外多糖分子量均一，分子量在21kd左右，而胞内多糖的分子量不均一。3.硅胶薄层色谱法初步分析，P1、P2多糖的单糖组分均为半乳糖和甘露糖。通过气相色谱分析，P1的半乳糖与甘露糖的比例为1:1.18。【结论】本实验成功地从烟曲霉菌的胞外发酵液中分离到纯度高、分子量均一的半乳甘露聚糖，分子量和单糖组成与文献报道一致，基本符合适配子筛选的要求，可以用于本科题组研制新的检测方法。而胞壁的多糖分子量不均一，结构较复杂，有待于进一步深入研究。