背景与目的：　　泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome stystem, UPS)是哺乳动物细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，参与调控细胞的增殖、分化和凋亡，细胞周期及细胞内信号转导等多种生理活动。泛素分子主要通过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2s和泛素-蛋白连接酶E3s与待降解的靶蛋白结合形成多聚泛素化链，最后被26S蛋白酶体系统识别并将其降解。26S蛋白酶体是一个由20S核心复合物和2个19S调节复合物组成的ATP依赖性蛋白水解酶复合体，其中20S核心蛋白酶是26S蛋白酶体的水解核心。硼替佐米/Velcade是20S蛋白酶体的抑制剂，在2003年已被美国FDA批准用于治疗临床多发性骨髓瘤并取得良好的疗效，证实了泛素蛋白酶体系统是肿瘤治疗的一个重要靶点，同时也吸引了研究者对泛素蛋白酶体途径中其他组分如去泛素化酶的研究，来寻找更有应用前景的抗肿瘤药物。本实验室前期对1-氧化吡啶巯基铂化合物（PtPT）的研究发现，它作为蛋白酶体相关去泛素化酶抑制剂可以在体内或体外表现出选择性的抗肿瘤效应，在此基础上，我们对PtPT的化学结构进行修饰，希望获得效果更好的治疗药物。　　实验方法：　　1、细胞活力测定：采用MTS法检测PtPT及其衍生物对肿瘤细胞活力的影响。　　2、细胞凋亡情况检测：采用Annexin V-FITC/Propidium iodide(PI)标记死亡细胞用流式细胞仪分析细胞凋亡情况；碘化丙叮(PI)荧光显微镜观察并拍照记录细胞形态学变化。　　3、死亡相关蛋白的检测：采用Western bolt法检测。　　4、裸鼠载体实验：A549细胞接种于裸鼠两侧腋下，PtPT及其衍生物腹腔注射观察并记录给药组和对照组裸鼠体重和肿瘤体积的变化。　　5、免疫组化：检测肿瘤组织中的蛋白表达情况。　　实验结果：　　1、PtPT衍生物细胞毒性筛选　　选用人骨髓瘤细胞U266，人非小细胞肺癌细胞A549及慢性粒细胞白血病细胞 K562为研究对象进行处理，PtPT及其衍生物作用细胞48h之后，采用MTS方法检测，发现2、4、7号衍生物（PtPT-2、PtPT-4、PtPT-7）能够明显抑制细胞活力。　　2、比较PtPT及其衍生物对肿瘤细胞的毒性及泛素-蛋白酶体功能的影响　　（1）细胞活力：不同浓度的PtPT及PtPT-2、PtPT-4、PtPT-7作用于慢性粒细胞白血病细胞K562，人骨髓瘤细胞U266及人非小细胞肺癌细胞A549细胞48h后，MTS法检测细胞活力呈浓度依赖性下降，并且发现PtPT-4的作用强于PtPT，PtPT-2和PtPT-7效应弱于PtPT。　　（2）细胞死亡和UPS功能的变化：　　处理慢性粒细胞白血病细胞K562，人骨髓瘤细胞U266及人非小细胞肺癌细胞A549细胞株24h后，采用荧光显微镜活细胞动态观察拍照，观察到PtPT及其PtPT-2、PtPT-4、PtPT-7能浓度依赖性的诱导细胞死亡，且PtPT-4组的细胞死亡明显多于PtPT组。　　选用人骨髓瘤细胞U266及人非小细胞肺癌细胞A549细胞为研究对象，不同浓度PtPT及PtPT-4（1.25、2.5、5μM）处理细胞24h后用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测细胞死亡情况，发现PtPT-4组明显强于PtPT组。　　PtPT及PtPT-4处理慢性粒细胞白血病细胞K562，人骨髓瘤细胞U266及人非小细胞肺癌细胞A549细胞24h后采用Western blot技术检测了相关蛋白的变化。结果发现：PtPT及其衍生物均可诱导蛋白酶体泛素化底物蛋白Ub增加、PARP切割及Caspase-3/-8/-9切割，其中PtPT-4效果均优于PtPT，而PtPT-2、PtPT-7弱于PtPT的效应。　　3、PtPT及其衍生物对临床白血病病人细胞及正常人的外周血单个核细胞毒性的影响　　（1）细胞活力变化：PtPT及PtPT-2、PtPT-4、PtPT-7分别处理临床白血病病人细胞及正常人的外周血单个核细胞48h后采用MTS法检测到PtPT、PtPT-2、PtPT-4、PtPT-7均能够明显抑制白血病病人细胞增殖，且存在浓度依赖关系。而对正常人的外周血细胞的抑制只有高浓度有明显效果。　　（2）细胞死亡变化：同等条件分别处理临床白血病病人细胞及正常人的外周血单个核细胞24h，采用荧光显微镜活细胞动态观察拍照，观察PtPT、PtPT-2、PtPT-4、PtPT-7浓度依赖性抑制白血病病人细胞增殖，而24h后对正常人的外周血细胞的抑制不明显或高浓度时才表现出抑制效应。　　4、PtPT及PtPT-4对BALB/c裸鼠异种移植瘤的影响　　（1）PtPT及PtPT-4对在体肿瘤生长抑制作用：裸鼠接种人非小细胞肺癌细胞A549细胞株后PtPT及PtPT-4按5mg/kg剂量给药十五天，观察到裸鼠体重与对照组相比没有出现下降，给药组肿瘤组织体积逐渐减小，瘤重明显降低。PtPT与PtPT-4在体抗肿瘤作用无统计学差异。　　（2）肿瘤组织相关蛋白变化：PtPT-4处理组肿瘤组织免疫组化染色结果表明蛋白酶体泛素化底物蛋白 Ub，K48泛素蛋白及 p21蛋白，Cleaved-caspase3蛋白明显增加。　　结论：　　1、PtPT及PtPT衍生物2、4、7号能引起UPS功能抑制和诱导细胞凋亡作用，其中PtPT-4衍生物效果最佳。　　2、PtPT-4衍生物在体内能够明显抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长和蛋白酶体功能。