再生障碍性贫血（简称再障）是一种骨髓衰竭性疾病,以骨髓造血功能低下和全血细胞减少为特征。近年来认为,再障的主要发病机制是T细胞介导的骨髓特异性的自身免疫反应。根据T细胞表面跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶CD45RA和趋化因子受体CCR7的表达与否,T细胞可分为初始T细胞、中心记忆性T细胞(T_CM细胞)和效应记忆性T细胞(T_EM细胞)亚群。研究发现再障患者中存在T细胞优势克隆群,呈寡克隆扩增的T细胞具有自身反应性,显示出记忆/效应细胞表型,提示记忆性T细胞亚群可能在再障的发病过程中发挥重要作用。T细胞表面钾离子通道与T细胞的活化有着极为重要的关系。人类T细胞表面两种钾离子通道,电压门控钾通道Kv1.3和钙依赖性钾通道KCa3.1可通过对膜电位和Ca²⁺信号通路的调控,调节T细胞的活化和功能。不同T细胞亚群活化时,钾离子通道的表达有所不同。T_EM细胞活化时高表达Kv1.3通道,而低表达KCa3.1通道,Kv1.3通道是T_EM细胞活化的主要离子通道。而在初始T细胞和T_CM活化时,KCa3.1通道表达增加,发挥主要功能,Kv1.3通道无明显增加。阻断Kv1.3通道,可以有效抑制T_EM细胞的增殖及效应功能。本研究检测了再障初始和记忆性T细胞亚群的变化及T细胞活化时Kv1.3通道的表达,分析Kv1.3通道在再障T细胞及初始、记忆性T细胞亚群活化中的作用,探讨Kv1.3通道作为再障免疫治疗靶点的可能性。第一部分再生障碍性贫血患者初始和记忆性T细胞亚群数量及功能的研究目的:研究再障患者骨髓及外周血CD4⁺及CD8⁺T细胞中初始T细胞、T_CM细胞和T_EM细胞的数量及分泌细胞因子IFN-γ的功能。方法:1.再障外周血及骨髓中初始和记忆性T细胞亚群数量的检测:抽取再障患者和正常对照外周血及骨髓液进行单个核细胞的分离,流式细胞术检测外周血单个核细胞（PBMCs）及骨髓单个核细胞（BMMNCs）的CD4⁺及CD8⁺T细胞中初始T细胞（CD45RA⁺CCR7⁺）、T_CM细胞（CD45RA^-CCR7⁺）和T_EM细胞(CD45RA^-CCR7^-,CD8⁺T细胞还包括终末分化的CD45RA⁺CCR7^-T_EM细胞)的比例。2.再障外周血及骨髓中初始和记忆性T细胞亚群功能的检测:培养再障患者和正常对照外周血及骨髓单个核细胞,加入佛波酯PMA、离子霉素刺激T细胞活化,莫能霉素阻断细胞因子向胞外释放。培养5h后,流式细胞术检测CD4⁺及CD8⁺T细胞中CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞和CCR7^-T_EM细胞IFN-γ的表达情况。结果:1.再障患者与正常对照的初始和记忆性T细胞亚群的比较:在PBMCs及BMMNCs的CD4⁺T细胞中,再障患者初始T细胞的比例明显低于正常对照（p＜0.001）,再障患者T_EM细胞的比例明显高于正常对照（p＜0.001）,T_CM细胞比例在再障患者及正常对照之间无明显差异。在PBMCs及BMMNCs的CD8⁺T细胞中,再障患者初始T细胞的比例明显低于正常对照（p＜0.001）,而T_EM细胞及终末T_EM细胞的比例均明显高于正常对照（p＜0.001）,T_CM细胞比例在再障患者及正常对照之间无明显差异。2.外周血与骨髓中初始和记忆性T细胞亚群的比较:再障患者的CD4⁺初始和记忆性T细胞亚群,在外周血与骨髓之间未见明显差异;正常对照的CD4⁺T细胞亚群,在外周血与骨髓之间也未见明显差异。而再障患者骨髓中的CD8⁺终末T_EM细胞的比例较外周血中明显增加（p=0.002）,CD8⁺初始T细胞的比例较外周血中减少（p＜0.001）;正常对照的CD8⁺初始和记忆性T细胞亚群,在外周血与骨髓之间未见明显差异。3.重型再障（SAA）患者与非重型再障（NSAA）患者的初始和记忆性T细胞亚群的比较:PBMCs及BMMNCs中的CD4⁺T细胞亚群,SAA组与NSAA组间未见明显差异;PBMCs及BMMNCs中的CD8⁺T细胞亚群,两组间也未见明显差异。4.初始和记忆性T细胞亚群IFN-γ的表达水平:在再障患者和正常对照的PBMCs及BMMNCs的CD4⁺T细胞中,IFN-γ⁺CCR7^-T_EM细胞比例明显高于IFN-γ⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞（p＜0.001）;同样的,CD8⁺T细胞中,IFN-γ⁺CCR7^-T_EM细胞比例明显高于IFN-γ⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞（p＜0.001）。5.再障患者与正常对照的初始和记忆性T细胞亚群IFN-γ表达水平的比较:再障患者PBMCs及BMMNCs的CD4⁺和CD8⁺T细胞中,IFN-γ⁺CCR7^-T_EM细胞比例均明显高于正常对照（p＜0.001）;而在PBMCs及BMMNCs的CD4⁺和CD8⁺T细胞中,再障患者及正常对照的IFN-γ⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞比例未见明显差异。在再障患者PBMCs及BMMNCs的CD4⁺CCR7^-T_EM细胞中,表达IFN-γ的细胞比例较正常对照无明显增高;而在再障患者PBMCs及BMMNCs的CD8⁺CCR7^-T_EM细胞中,表达IFN-γ的细胞比例较正常对照明显增高（p＜0.001）。结论:再障外周血及骨髓CD4⁺和CD8⁺T细胞中T_EM细胞数量明显增高,骨髓中CD8⁺终末T_EM细胞又较外周血中明显增高;再障的T_EM细胞,较自身初始T细胞、T_CM细胞及正常对照的T_EM细胞,可表达大量造血负调控因子IFN-γ,提示T_EM细胞是再障中主要的效应细胞,可能参与再障的发病过程。第二部分电压门控钾通道Kv1.3在再生障碍性贫血患者T细胞中的表达目的:研究再障患者骨髓活化T细胞中Kv1.3通道的表达情况。方法:1.骨髓T细胞的活化:抽取再障患者和正常对照的骨髓液,进行T细胞的分离,以抗CD3单抗刺激T细胞活化,培养72h。2.荧光实时定量RT-PCR检测再障活化T细胞中Kv1.3通道mRNA表达水平。3.Western blot检测再障活化T细胞中Kv1.3通道蛋白表达水平。4.荧光显微镜检测再障活化T细胞膜表面Kv1.3通道及CCR7的表达情况。5.流式细胞术检测再障活化CD4⁺及CD8⁺T细胞中初始T细胞、T_CM细胞和T_EM细胞的比例。结果:1.再障患者骨髓T细胞活化后Kv1.3通道mRNA的表达与正常对照相比明显增高（p=0.001）。2.再障患者骨髓T细胞活化后Kv1.3通道蛋白的表达与正常对照相比明显增高（p=0.001）。3.荧光显微镜下,再障患者骨髓活化T细胞主要为低表达CCR7的CCR7^-T_EM细胞,这些细胞Kv1.3通道呈现高表达;正常对照的T细胞主要为高表达CCR7的CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞,而这些细胞表面低表达Kv1.3通道。4.流式细胞术结果显示,在骨髓活化的CD4⁺T细胞中,再障患者T_EM细胞的比例明显高于正常对照（p＜0.001）,再障患者初始T细胞的比例明显低于正常对照（p＜0.001）,T_CM细胞比例在再障患者及正常对照之间无明显差异。在CD8⁺T细胞中,再障患者T_EM细胞及终末T_EM细胞的比例均明显高于正常对照（分别为p＜0.001,p=0.001）,初始T细胞的比例明显低于正常对照（p＜0.001）,T_CM细胞比例在再障患者及正常对照之间无明显差异。T_EM细胞是再障患者骨髓活化T细胞中的主要细胞群体。结论:再障患者活化的骨髓T细胞中Kv1.3通道在mRNA及蛋白水平的表达较正常明显增高,这与再障T细胞中T_EM细胞的数量增加及T_EM细胞活化时高表达Kv1.3通道有关。第三部分阻断Kv1.3通道对再生障碍性贫血患者T细胞及T细胞亚群的影响目的:研究阻断Kv1.3通道对再障患者骨髓T细胞及T细胞亚群增殖及功能的影响。方法:1.骨髓T细胞的培养:抽取再障患者骨髓液,进行T细胞的分离,以抗CD3单抗刺激T细胞活化的同时,加入或不加入Kv1.3通道特异性阻断剂ShK,培养72h。2.阻断Kv1.3通道对再障骨髓T细胞增殖及功能的影响的检测:CCK-8法检测不同处理组再障患者T细胞增殖的情况,ELISA法检测不同处理组培养上清中IFN-γ及IL-4的浓度。3.CFSE荧光标记法检测阻断Kv1.3通道对再障骨髓T细胞亚群增殖的影响:再障患者骨髓T细胞刺激前标记CFSE荧光染料,培养72h后通过流式细胞术检测CFSE的变化,分析不同处理组CD4⁺和CD8⁺T细胞中CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞、CCR7^-T_EM细胞增殖的变化。4.流式细胞术检测阻断Kv1.3通道对再障骨髓T细胞亚群功能的影响:分析不同处理组CD4⁺和CD8⁺T细胞中CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞、CCR7^-T_EM细胞表达细胞因子IFN-γ及IL-4水平的变化。结果:1.Kv1.3通道阻断剂ShK可明显抑制再障患者骨髓T细胞的增殖（p＜0.001）。2.阻断Kv1.3通道对再障骨髓T细胞分泌细胞因子水平的影响:ShK加入培养体系后,再障患者培养上清中IFN-γ水平显著降低（p＜0.001）,IL-4水平未见明显改变。3.阻断Kv1.3通道对再障骨髓T细胞亚群增殖的影响:CFSE^low细胞代表增殖的细胞,在ShK加入培养体系后,CD4⁺CCR7^-T_EM细胞及CD8⁺CCR7^-T_EM细胞中CFSE^low细胞比例均显著降低（p＜0.001）,而CD4⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞及CD8⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞中CFSE^low细胞比例未见明显降低。4.阻断Kv1.3通道对再障骨髓T细胞亚群表达细胞因子水平的影响:CD4⁺及CD8⁺T细胞中,分泌IFN-γ和IL-4的细胞主要为CCR7^-T_EM细胞。ShK加入培养体系后,CD4⁺CCR7^-T_EM细胞及CD8⁺CCR7^-T_EM细胞中表达IFN-γ的细胞比例显著降低（分别为p=0.002,p＜0.001）,而CD4⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞及CD8⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞中表达IFN-γ的细胞比例未见明显降低;CD4⁺和CD8⁺CCR7⁺初始T细胞/T_CM细胞及CD4⁺和CD8⁺CCR7^-T_EM细胞中表达IL-4的细胞比例均未见明显降低。结论:特异性阻断Kv1.3通道,可抑制再障T细胞的增殖及功能,其中主要抑制T_EM细胞亚群的增殖及功能,对初始T细胞及T_CM细胞影响不大;Kv1.3通道在再障T_EM细胞活化过程中发挥重要作用;Kv1.3通道可能成为再障免疫治疗的新靶点。