人胚胎干细胞抗氧化特性的探究

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目的:目前关于人胚胎干细胞(hESCs)对氧化应激反应以及细胞的抗氧化特性尚不完全清楚。本研究探索在氧化应激下在人胚胎干细胞(hESCs)和人角膜上皮细胞(HCE)的不同反应和作用及其机制研究,进一步阐述ESCs抗氧化应激的细胞特性及机制。方法:利用H2O2和4-羟基壬烯醛(HNE)诱导的两种不同氧化应激模型重点观察、比较人胚胎干细胞(hESCs,选用H1细胞)和人成熟实体细胞:人角膜上皮细胞(HCE)的不同反应。通过CCK8细胞活性实验分别检测不同浓度的H2O2和HNE对H1、HCE以及人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人胃上皮细胞(GES-1)的影响;通过流式细胞术检测H1和HCE两种细胞内活性氧物质ROS的水平;利用免疫印迹方法来检测H1和HCE细胞内氧化应激标志物3-硝基酪氨酸(3-NT)的含量;通过实时定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹、酶活性试剂盒等方法检测两种细胞内主要氧化酶NADPH氧化酶和抗氧化因子超氧化物岐酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽巯基转移酶(GSTP)、过氧化物酶(PRDX)的表达情况以及细胞自噬水平的激活情况。同时通过药理学手段NOX4的激动剂—佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(TPA)来验证H2O2诱导hESCs中NOX4的变化。结果:在H2O2和HNE两种不同氧化应激模型中的CCK8细胞活性实验结果显示,在相同应激条件下,H1表现出较强的活性作用,而HCE和GES-1存活受到抑制,且HUVECs受到的抑制更为明显,呈浓度依赖性关系。流式实验测定活性氧(ROS)的结果显示,在相同应激条件下,ROS的表达水平在H1内无明显变化,而在HCE内ROS表达水平升高。Western Blot结果显示,在给予H2O2刺激24h后,H1细胞内的氧化应激标志物3-NT下降,而在HCE细胞内升高。SOD和Catalase试剂盒和qRT-PCR结果显示,在给予H2O2刺激24小时后,H1中的SOD和CAT表达水平上调,在HCE中下调。qRT-PCR和Western Blot结果显示在分别给予H2O2和HNE刺激4小时后,H1中的GSTP和PRDX1表达水平上调,在HCE中下调。同时,在分别给予H2O2和HNE刺激4小时后,H1中相关自噬标志物:Beclin1,Atg5-12和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均上升,而P62蛋白表达下降;HCE结果与其相反。结果表明H1中的自噬在氧化应激的早期阶段被激活,而HCE细胞的自噬未被激活或被抑制。结论:分别在H2O2和HNE诱导的氧化应激条件下,人胚胎干细胞(hESCs)较人角膜上皮细胞(HCE)具有显著的抗氧化特性,其机制是上调相关抗氧化酶及激活早期自噬而实现的。结果较为深入地证明人胚胎干细胞具有较强的抗氧化能力,对干细胞的自身特性、分化、功能以及潜在临床应用的相关研究提供的新的实验证据并有一定的指导意义。
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