KCNE2基因编码产物为只含有一个跨膜结构的MinK相关蛋白1(Mink-related protein 1, MiRP1),又称KCNE2蛋白,含123个氨基酸,单独表达不具有通道功能,是泛宿主性β亚单位,对多种电压依赖性钾通道的α亚单位,如HERG(快激活延迟整流钾电流,fast component of delayed rectifier potassium current, Ikr的α亚单位)、Kv4.x (x=2/3)和Kv3.4(瞬间外向钾电流,transient outward current, Ito的α亚单位)、KCNQ1(慢激活延迟整流钾电流,slow component of delayed rectifier potassium current, Iks的α亚单位)以及超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道HCNx (x=1/2)(心脏起搏通道电流,funny current,If的α亚单位)等起到调节作用。KCNE2基因突变导致获得性和遗传性长QT间期综合症(LQTS)的具体作用机制现在还不清楚。随着研究的深入,离子通道功能的改变在各种心肌肥大模型中备受关注。几乎所有心肌肥大模型都发现Ito功能下调；部分心肌肥大模型检测到Iks功能下调。一直以来认为钾离子通道重建是心肌肥大的结果,而近几年研究表明,钾离子通道功能下调参与心肌肥大的发生。而KCNE2作为Ito与Iks通道β亚基之一,现已发现在心肌梗塞狗的模型中表达减少,而老年大鼠与自发性高血压大鼠(SHR)心肌细胞的KCNE2表达增加。KCNE2表达水平的改变是否会通过影响心脏的电生理学特性而在心脏病变过程中起着一定的作用,尚有待于从电生理水平上进一步研究。第一部分引起LQTS的KCNE2的两种突变体I57T和V65M对Kv4.3通道功能的调节本实验在哺乳细胞系COS-7表达系统利用膜片钳全细胞记录方式,研究了两种LQT6相关的突变体157T和V65M对Kv4.3通道功能的影响,从KCNE2对Ito功能调控的改变探讨LQT6引起心律失常的电生理机制。结果发现：1.1 I57T和V65M对Kv4.3通道电流密度和动力学的调节Kv4.3和KCNE2共表达电流密度较Kv4.3单独表达有降低的趋势。突变体I57T和V65M虽然也使Kv4.3通道的电流密度有所降低,但无显著性差异。KCNE2显著减慢Kv4.3通道的激活和失活。I57T对通道动力学的影响与Kv4.3单独表达时相似,TTP和T0.5与Kv4.3单独表达时无显著差异,但显著快于Kv4.3和KCNE2共表达的TTP (P=0.000)和T0.5(P=0.021)。而V65M对通道动力学的作用与I57T的正好相反,不仅使TTP和To.5的值显著高于Kv4.3单独表达时的值(分别为P=0.008和P=0.021),而且也高于Kv4.3和KCNE2共表达的TTP和T0.5,但在两组之间无显著差异。1.2 I57T和V65M对Kv4.3通道电压依赖性失活的影响KCNE2使Kv4.3电压依赖性失活曲线正向移位,P=0.020。I57T使电压依赖性失活曲线更靠近Kv4.3通道,甚至有轻微的负向移位,与单独表达的Kv4.3无显著差异(P=0.740)。较之Kv4.3通道,V65M使电压依赖性失活曲线正向移位,(P=0.001),但较Kv4.3与KCNE2共表达通道缺乏显著性差异。四组间的k值没有统计学差异,说明KCNE2及其突变体不改变Kv4.3的离子选择性。1.3 I57T和V65M对Kv4.3通道从失活中恢复特性的影响KCNE2使Kv4.3从失活中恢复的速度加快,P=0.047. KCNE2不引起Kv4.3出现显著的超射现象。I57T减慢Kv4.3从失活中恢复,但与Kv4.3和Kv4.3+KCNE2相比都缺乏显著性差异。而V65M能进一步加快Kv4.3从失活中恢复,虽然与Kv4.3+KCNE2相比无显著性差异,但显著小于Kv4.3,P=0.010。结论：KCNE2对Kv4.3通道功能具有明显的调控作用,减慢通道的激活和失活,使电压依赖性失活正向移位,同时加快通道从失活中的恢复。I57T与Kv4.3共表达的通道,表现为丧失KCNE2的功能——"loss of function",而V65M的作用则与之相反,表现为增强KCNE2的功能——"gain of function"。由此推论,KCNE2基因突变,无论是增强(V65M)还是减弱(I57T)其功能都可能改变Ito在心脏电稳定性中的作用。第二部分KCNE2与KChIP2c共表达对COS-7细胞上表达的Kv4.2通道电流特性的调节现在广泛认为KChIP2是心肌细胞瞬间外向钾通道Ito的“必须”β亚基。但是Kv4-KChIP2通道仍不能完全模拟自然的Ito,提示KChIP2不是生理状态下心肌细胞瞬间外向钾通道Ito的唯一“必须”β亚基。现有证据表明KCNE2极有可能作为p亚基参与调节心肌细胞Ito通道功能。而以往KCNE2对Kv4.3和Kv4.2作用的结果都是在缺乏KChIP2存在的条件下得到,在KChIP2存在时KCNE2是否仍然能够与Kv4.3和Kv4.2结合并发挥类似的调节作用呢?本实验采用将KChIP2与KCNE2共表达于COS-7细胞以检测KCNE2在KChIP2存在的条件下对Kv4.2通道的调节作用,发现：2.1 KChIP2c与KCNE2共表达对Kv4.2通道电流密度和门控动力学的影响KChIP2c和Kv4.2共表达显著增加Kv4.2通道电流密度2.3倍。KCNE2和Kv4.2共表达不显著改变Kv4.2通道电流密度。而KCNE2, KChIP2c和Kv4.2三者共表达时电流密度与KChIP2c和Kv4.2共表达的电流密度无显著性差异。提示当三者共表达时,对Kv4.2通道电流密度的调节作用KChIP2c占主导地位。KChIP2c显著减慢Kv4.2通道的激活和失活,P均=0.000。而三者共表达时,KCNE2却没有进一步减慢通道的激活速率,与KChIP2c+Kv4.2共表达时的TTP无显著差异(P=0.680)。但三者共表达时KCNE2对通道失活速率的作用正好相反,T0.5显著高于KChIP2c+Kv4.2共表达时的值(P=0.002)。这表明在三者共表达时,KCNE2对Kv4.2通道激活和失活速率的调节作用并不一致。2.2 KChIP2c与KCNE2共表达对Kv4.2通道电压依赖性激活的影响KChIP2c使Kv4.2通道的电压依赖性激活曲线正向偏移8.0mV,P=0.000。当三者共表达时,KCNE2使KChIP2c电压依赖性激活正向移位的作用显著减弱,P=0.006,较Kv4.2单独表达组仅有2.7mV的正向移位,没有显著性差异。2.3 KChIP2c与KCNE2共表达对Kv4.2通道电压依赖性失活的影响KChIP2c使Kv4.2电压依赖性失活正向移位。当Kv4.2,KChIP2c与KCNE2三者共表达时,KCNE2没有影响KChIP2c使Kv4.2电压依赖性失活正向移位的作用,但同时也并没有使失活进一步正向移位,与Kv4.2与KChIP2c共表达组比较没有显著差异。KChIP2c与KCNE2均不会改变Kv4.2通道的离子选择性,斜率因子k无显著改变。2.4 KChIP2c与KCNE2共表达对从失活中恢复的影响KChIP2c使Kv4.2通道从失活中恢复的速度显著加快,P=0.000。当KChIP2c与KCNE2共表达时,恢复的速度进一步缩减,P=0.000. KCNE2与KChIP2c共表达引起超射(overshoot)现象,约有4%的电流增加。结论：KChIP2c、KCNE2与Kv4.2共表达时,所产生电流的门控动力学和电压依赖性更接近于自然的Ito通道。这表明在生理条件下,KChIP2c与KCNE2共同参与调节心肌细胞Ito通道的电生理学特性。而且KCNE2与KChIP2c共表达后对Kv4.2通道的调节作用并不是单纯的将二者的调节作用简单叠加,提示KCNE2与KChIP2c共表达后各自对Kv4.2通道的某些调节作用被改变,从而实现共同调节。第三部分KCNE2对成年大鼠心肌细胞离子通道功能和电生理特性的调节作用由于以往的实验研究均来源于异源表达系统,并且对心室肌细胞是否存在KCNE2有质疑,所以KCNE2在体的生理功能没有得到很好的研究。Dr. Tseng实验室于2004年在人类、狗和大鼠心室肌检测到KCNE2蛋白的表达,并且发现在梗死性心肌肥大时KCNE2表达明显降低,使受其调节的电压依赖性钾通道功能发生改变,从而为KCNE2在正常与疾病心脏电生理稳定性维持中的重要意义提供了直接的证据。本实验首次使用腺病毒载体技术,将KCNE2基因转染入分离培养的成年大鼠心肌细胞,使其超量表达以观测KCNE2蛋白在心肌电生理中的作用。并使用siRNA干扰技术实现反向调节,降低KCNE2蛋白表达,观测KCNE2表达低于生理水平时,是否可将KCNE2的效应逆转,从而研究KCNE2对心肌细胞自身离子通道的功能和电生理特性的调节作用。结果表明：3.1 KCNE2对瞬间外向钾通道(Ito)功能的调节3.1.1 KCNE2对瞬间外向钾通道(Ito)电流密度和门控动力学的影响AdKCNE2组Ito电流密度略低于AdGFP组,但没有统计学意义。siKCNE2组Ito电流密度比shRNA组略有增加,但二者相比同样没有显著性差异。KCNE2显著减慢了Ito通道的激活和失活动力学。反之shRNA组的TTP和T0.5显著慢于siKCNE2组的TTP和T0.5。3.1.2 KCNE2对瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性失活的影响过表达KCNE2使Ito通道电压依赖性失活曲线正向移位。K值在两组间没有显著差异。siKCNE2组表现出相反的效应,使Ito通道电压依赖性失活曲线向负电位移位,P=0.001。K值在两组间仍没有显著差异。3.1.3 KCNE2的改变对瞬间外向钾通道(Ito)α亚基蛋白表达的的影响KCNE2表达量的改变虽然使心肌细胞Kv4.3、Kv4.2蛋白膜表面表达量与各自相应的对照组相比略有改变,但无统计学差异(P均>0.05)。3.2 KCNE2的改变对心肌细胞L-型钙通道(ICa-L)的调节3.2.1 KCNE2的改变对心肌细胞L-型钙通道(ICa-L)电流的影响过表达KCNE2蛋白显著增加心肌细胞的L型钙电流,+10mV时AdKCNE2组钙电流密度较AdGFP组增加了约37.5%(P=0.024)。siKCNE2组则表现出相反的效应,比shRNA组钙电流密度减少约28.9%,P=0.000。而AdKCNE2组和siKCNE2组与各自对照组的半数失活电压(V0.5)相比均没有统计学差异。3.2.2 KCNE2的改变对L-型钙通道(ICa-L)α亚基蛋白(Cav1.2α1c)表达的影响KCNE2蛋白表达的改变使心肌细胞ICa-L Cav1.2α1c蛋白在表达量与各自相应的对照组相比均有显著性差异。AdKCNE2组较AdGFP组增加了约28%。siKCNE2组使这一效应逆转,比shRNA组表达量约下降约34%。3.3 KCNE2的改变对心肌细胞内向整流钾电流IK1的影响KCNE2的改变不影响IK1的反转电位及其整流特性,shRNA组和siKCNE2组无显著性差异,AdKCNE2组IK1电流密度较AdGFP组在-120 mV至-90 mV电压范围略有增加,但两组没有统计学差异。3.4 KCNE2对心肌细胞动作电位时程(APD)的影响AdKCNE2组APD20,APD50和APD90均较AdGFP组显著延长(P均<0.05)。而静息膜电位RMP没有发生改变。而siKCNE2组APD20, APD50和APD90较shRNA组显著缩短(P均<0.05),而RMP也没有发生改变。3.5 KCNE2的改变对心肌组织总蛋白含量和心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide, ANP) mRNA表达的影响用各组心肌细胞裂解液上清测定其总蛋白质含量。结果显示,KCNE2的过表达和抑制都显著导致心肌细胞总蛋白含量增加,与各自对照组比较分别增加了45.5%和29.7%。Realtime-PCR结果显示,与各自对照组比较,KCNE2的过表达和抑制均使ANP的转录水平显著增加。3.6大鼠心室肌细胞膜KCNE2的表达20-24月龄健康SD大鼠作为老年组,取其心室肌组织,检测心肌细胞膜KCNE2的表达,以3-4月龄SD大鼠作为成年组,刚出生1-3d的SD乳鼠作为幼年组。结果显示,KCNE2在心室肌细胞膜上的表达量随着年龄的增加而增加,该结果与文献报道一致。结论：KCNE2表达的改变影响了心肌细胞瞬间外向钾电流的门控动力学和电压依赖性,进而使动作电位时程发生相应的改变。而KCNE2蛋白表达的改变没有影响Itoα亚单位在细胞膜上的表达,这提示我们KCNE2作为β调节亚基,对Ito通道的调节作用是其与Kv4蛋白在细胞膜上组装成复合体后发生的,而没有影响Kv4蛋白转运到膜上的过程。令人惊讶的是,KCNE2的改变影响了L-型钙通道(ICa-L)的电流及其α亚基蛋白Cav1.2α1c表达,其机制值得我们深入探讨。而KCNE2的改变导致心肌细胞肥大以及老年性心脏中KCNE2表达显著增加更进一步表明KCNE2在正常与疾病心脏电生理稳定性中发挥着重要的作用。