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目的:构建靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)及靶向EpCAM嵌合共刺激受体(chimeric co-stimulatory receptor,CCR)的慢病毒重组质粒,在体外对Jurkat T细胞进行修饰,探讨EPCAM-CCR及EGFRvⅢ-CAR共修饰T细胞的体内外活化情况及肿瘤免疫效应。方法:合成获取EPCAM-CCR及EGFRvⅢ-CAR基因片段,利用基因工程技术将两段基因分别克隆入慢病毒表达载体,构建慢病毒重组质粒。利用非脂质体转染法通过三质粒包装系统包装慢病毒,感染并筛选稳转Jurkat T单克隆细胞株。PCR、Western Blot及流式细胞术验证Jurkat T单克隆细胞株中CCR及CAR的表达。Elisa法检测Jurkat T单克隆细胞株表面EPCAM ScFv、EGFRvⅢ ScFv的亲和力及体外活化状况。通过裸鼠荷瘤模型研究CCR及CAR共修饰的T细胞对裸鼠体内肿瘤的免疫效应。结果:1、成功构建CCR-T2A-CAR-PCDH慢病毒表达重组质粒,转染293T细胞,经Western blot验证CCR、CAR基因均能正常表达。2、成功包装出重组质粒慢病毒,将病毒浓缩后测得病毒的滴度为5×108 TU/mL。3、慢病毒成功感染Jurkat T细胞,并经筛选鉴定获得稳定表达CCR及CAR的CCR+CAR+Jurkat T单克隆细胞株;4、Elisa法检测CCR+CAR+Jurkat T单克隆细胞株表面ScFv与相应抗原蛋白间具有较高亲和力;通过与HepG2、Caco2细胞共培养显示,CCR+CAR+Jurkat T单克隆细胞株在体外能被有效激活且分泌IL-2细胞因子。5、体外处理的T淋巴细胞输注裸鼠荷瘤模型后,显示出一定程度的肿瘤免疫抑制作用。结论:成功筛选到由EPCAM-CCR及EGFRvⅢ-CAR共修饰的Jurkat T单克隆细胞株,并且此单克隆细胞株在体外对肿瘤细胞有一定靶向作用且能被有效激活;动物实验进一步证明CAR及嵌合共刺激受体修饰的T淋巴细胞对裸鼠体内肿瘤具有一定程度的免疫抑制作用,这对于抗肿瘤免疫研究具有重要的意义。