研究背景和目的: 近年来我国乳腺癌的发病率呈上升趋势，死亡率也在不断攀升，特别是京、津、沪等发达城市以及沿海的一些省份。虽然目前对乳腺癌的治疗已经取得了明显的进展，但远未达到根治乳腺癌目的，经过综合治疗后乳腺癌仍然可能复发转移。这主要是因为，目前用于控制复发和转移的手段主要依赖于放疗和化疗以及内分泌治疗，而药物通常只是作用于增生活跃的癌细胞，对处于静息期的癌细胞以及构成肿瘤生长微环境的间质成分则作用不大。而这些间质成分则是日后肿瘤复发转移的根源。 构成肿瘤生长微环境的间质成分包括维持肿瘤生长和作为日后远处转移途径的血管；包括分泌细胞外基质、为肿瘤的生长提供了支架的成纤维细胞；此外还有巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞、中性粒细胞等炎症细胞及这些细胞所分泌的细胞因子和化学介质。在这些间质成分中，巨噬细胞作为一种功能多样化的细胞，可以通过多种途径影响着肿瘤的发生发展。目前研究认为，体内的单核细胞主要存在两种活化方式，一种是以细菌脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)或γ-干扰素(interferon-γ，INF-γ)诱导的经典激活(classicalactivation)，经典激活的单核细胞主要以表达TNF-α为标志；一种是以Th2型细胞因子白细胞介素4(interlukin-4，IL-4)等诱导的替代激活(alternativeactivation)，替代激活的单核细胞主要以表达巨噬细胞替代激活相关化学因子-1(Altemative Macrophage Activation-Associated CC．Chemokine-1，AMAC-1)为标志。那么这两种激活状态的单核细胞对肿瘤细胞到底有什么影响?与肿瘤中的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞TAM的作用有无相似之处?故此我们以人外周血单核细胞为研究对象，采用LPS、IL-4在体外分别刺激单核细胞向不同的功能状态分化，观察不同活化状态的单核巨噬细胞对乳腺癌细胞生长侵袭的影响。进而探讨TAM在肿瘤发展中可能的作用机制。 方法: 1.人外周血单核细胞的分离培养及诱导活化取健康成人外周血100-200ml，肝素抗凝处理后，PBS溶液等倍稀释，采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，PBS洗涤，接种于六孔培养板内在37℃、5﹪C O 2条件下孵育1 h，反复洗去悬浮的淋巴细胞，得到贴壁的单核细胞。用含10﹪胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI-1640培养基培养3-5天，根据激活介质的不同将其分为三组：LPS组、IL-4组、培养基空白对照组，每组5个复孔.分别加入LPS(终浓度25u个/ml)，IL-4(终浓度15ng/ml)，对照组不任何介质，37℃、5﹪C O 2条件下继续培养48-72小时后监测相应分子标志物及进行下一步实验。 2.采用RT-PCR监测不同激活状态的单核细胞分子标志物mRNA的表达差异分别消化收集经不同介质处理48-72 h的单核细胞，用TRIzol.一步法提取总RNA，以RT-PCR检测单核巨噬细胞经典激活分子标志物TNF-α、替代激活分子标志物AMAC-1以及分子内参照β-actin mRNA的表达，产物经琼脂糖凝胶电泳后在UVI凝胶成像系统下成像观察各组间表达差异，Gel pro analyser3.2软件做半定量分析琼脂糖凝胶电泳图。各组细胞因子与β-actin条带的灰度比(TNF-α/β-actin，AMAC-1/β-actin)作为各细胞因子mRNA的相对表达丰度，结果以x±s表示。 3.共培养观察不同活化状态的单核细胞对人乳腺癌细胞株SKBR3生长侵袭的影响.将SKBR3细胞与经过相关因子处理48小时后的单核细胞消化后分别接种于Transwell(滤膜孔径0.4um)内小室中和外室进行共培养，按单核细胞处理因素的不同分为LPS组、IL-4组、未激活组以及不含单核细胞的空白对照组，在共培养体系下共进行如下三个方面的试验：每24小时采用MTT法监测SKBR3细胞的生长情况，共5天，观察不同激活的单核细胞对SKBR3生长曲线的影响；共培养24小时后，采用氚标记脱氧嘧啶核苷酸(3H-TdR)掺入实验检测不同激活状态的单核细胞对SKBR3的摄取3H-TdR的影响；采用细胞划痕法观察单核细胞对SKBR3乳腺癌细胞迁移能力的影响。 4.建立鸡胚尿囊膜血管生成模型观察不同活化状态的单核细胞对乳腺癌细胞诱导新生血管生成的影响将3日龄健康江高黄鸡鸡胚消毒后置于超净台中，卵壳开窗，剪除卵膜，暴露血管丰富的尿囊膜，接种细胞于尿囊膜两大血管之间的相对无血管区，分五组：RPMI-1640培养基空白对照组、单纯SKBR3细胞组、未激活单核细胞+SKBR3组、经典激活单核细胞+SKBR3组、替代激活单核细胞+SKBR3组，每组10只，封闭窗口，将鸡胚置于温度37.5℃，湿度50﹪的恒温箱中继续孵育至10日龄，滴加10﹪的福尔马林杀死鸡胚并固定尿囊膜组织，将尿囊膜组织平铺于载玻片上并加盖盖玻片后置于四倍解剖显微镜下观察并拍照，选取清晰的照片记录汇聚血管的数量，数据以x±s表示，分析三种不同活化状态的单核巨噬细胞对肿瘤诱导新生血管形成的影响。 结果: 1.RT-PCR监测不同激活状态的单核细胞分子标志物mRNA的表达情况LPS激活的单核细胞明显高表达TNF-α，低表达AMAC-1；IL-4激活的单核细胞则高表达AMAC-1，低表达TNF-α；而未分化的单核细胞则两种细胞因子均有低表达。将琼脂糖凝胶电泳图中各组TNF-α，AMAC-1条带平均灰度值与β-actin平均灰度值比较进行半定量分析，结果显示：经典激活的单核细胞其TNF-α的表达均明显高于替代激活的单核细胞及培养基对照组(P<0.05)；替代激活的单核细胞其表达的AMAC-1也明显的高于其他两组，统计学检验均存在差异(P<0.05)。 2.不同激活状态的单核巨噬细胞对人乳腺癌细胞株SKBR3生长、代谢、迁移的影响通过将不同活化状态的单核巨噬细胞同乳腺癌细胞SKBR3共培养实验，发现LPS经典激活的单核细胞呈现出明显抑瘤效应，3天后曲线明显低于其它3组(P<0.05)，随时间的推移愈加明显；IL-4替代激活的单核细胞则在第5天开始呈现出明显促肿瘤效应高于单纯培养剂对照组与经典激活组(P<0.05)。与未激活组无名显差别。未激活组在共培养的过程中也呈现出促肿瘤生长的趋势，明显高于经典激活组，但与单纯培养基组对照组之间但未达到统计学意义的差异在代谢实验中，各组SKBR3对3H-TdR的摄取自30分钟开始逐渐增强，2小时后渐趋平稳。各组中以替代激活组的SKBR3摄取最强，其余个组水平依次为未激活组、对照组、经典激活组。替代激活的单核细胞对3H-TdR的摄取，2h显著高于对照组(P=0.017)；30min、2h显著高于经典激活组(P=0.001；P=0.0003)：各时点虽然也高于未激活组，但缺乏统计学意义。而经典激活组SKBR3在30分钟时的摄取率则明显低于未激活组(P=0.014)，2h，4h也低于未激活组，但未达到统计学意义(P=0.07，P=0.08)。以及2h低于对照组(P=0.01)，其余各时点虽然也低于对照组，但是缺乏统计学差异。效应指数分析显示，替代激活单核细胞在各时间点上表现出的均为正效应(>1)，而经典激活的单核细胞则均为负性效应(<1)。未激活的单核细胞其作用类似于替代激活的单核细胞。 在细胞迁移实验中，替代激活以及未激活的单核细胞在共培养时能够明显增强乳腺癌细胞的迁移力，经典激活的单核细胞则可以抑制单核细胞的迁移。 通过实验我们发现不同激活状态的单核细胞对于乳腺癌细胞动力学的影响是不同的，这种影响可以通过非细胞接触的方式来实现，反过来乳腺癌细胞也可以通过细胞问的介质诱导单核细胞向替代激活的方向分化。 3.不同激活状态的单核巨噬细胞对乳腺癌细胞株SKBR3诱导肿瘤血管生成的影响在不同激活的单核巨噬细胞存在的情况下，各组乳腺癌细胞诱导生成的肿瘤新生血管以接种部位为中心，呈汇聚生长。经4倍光学显微镜下对新生的汇聚血管进行计数量化处理，以x±s表示。以各组平均新生血管的数量按从多到少的顺序依次为：IL-4激活的单核细胞(57±14)、未激活组的单核细胞(32±8)、LPS激活的单核细胞(20±6)、单纯癌细胞组(14±6)。替代激活的单核细胞组对肿瘤细胞新生血管诱导生成的能力明显高于其他各组，统计学检验有显著性差异(P<0.05)，而空白培养基对照组无汇聚血管的形成。 结论: 单核细胞可以被不同的细胞因子诱导向不同的活化方向分化；不同活化的单核细胞各自表达不同的分子标志物，经典激活的单核细胞表达TNF-α，替代激活的单核细胞表达AMAC-1；在体外共培养的情况下替代激活的单核细胞可以促进肿瘤细胞的生长、代谢及迁移能力，而经典激活的单核细胞则可以抑制肿瘤生长、代谢以及迁移。肿瘤细胞还可以通过细胞间介质的作用诱导未分化成熟的单核细胞向替代激活的方向分化。在模拟体内生长的状态下不同状态的单核细胞都可促进肿瘤细胞诱导血管生成的能力，但以替代激活的方式最明显。这些实验证据显示，TAM可能以一种类似替代激活的状态存在于肿瘤中，通过直接或者是间接的方式促进肿瘤的发展。