登革病毒（Dengue virus，DENV）是登革热(classical dengue fever，DF)和登革出血热/登革休克综合症(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/DSS)的病原体[1]。近年来，随着旅游业的发展和地球温暖化，世界范围内DF和DHF/DSS的流行、暴发更加频繁，影响范围在不断扩大，发病率不断增加。据WHO最新统计，热带与亚热带地区每年有超过3.9亿人感染DENV。值得一提的是，2013年夏季，我国广东、云南有大范围的DF疫情，且有较多的重症病例。因而WHO再次发布报告，认为DF已成为全球蔓延最快的病种，亟待研制安全有效的疫苗、特效抗病毒药物进行防治。DENV属于黄病毒科、黄病毒属的单股正链RNA病毒，有四种血清型(DENV1-4）[2]，DENV基因组大约为11kb，1个开放读码框编码三种结构蛋白包膜糖蛋白（E）、膜蛋白（M）和衣壳蛋白（C），以及七种非结构蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5[3，4]。病毒表面的包膜蛋白E蛋白是DENV病毒体上的包膜糖蛋白和最大的结构蛋白，在病毒吸附、与宿主细胞膜融合以及病毒组装过程中具有重要的作用，是DENV吸附于靶细胞与受体相互作用的病毒表面特异性吸附蛋白[5]。prM蛋白是未成熟病毒颗粒中的膜蛋白前体，prM蛋白的N端序列被蛋白酶切除后即生成M蛋白，只有含M蛋白的成熟病毒颗粒才能介导包膜糖蛋白E与细胞膜以酸性pH依赖型的方式发生融合[6]。DENV NS1蛋白的分子量约为42~50KDa，在DENV感染细胞内合成的NS1蛋白通过E蛋白C端末尾的疏水性信号序列进入内质网，随后信号肽酶作用于E/NS1的连接处最终产生成熟的NS1蛋白。成熟的NS1蛋白以细胞内、细胞膜和细胞外分泌的形式存在，NS1蛋白有助于免疫复合物的形成，诱发机体产生保护性抗体[7]。DHF/DSS是DENV感染的重症，其特征性的临床表现之一是血管通透性增加引起的渗出和出血，但对于血管通透性增加的机制尚未完全阐明。已知整合素家族是重要的细胞外基质蛋白，其中的整合素β3和β1主要分布在血管内皮细胞表面，在维持血管壁完整性上发挥着重要作用。课题组前期研究发现DENV-2感染HMEC-1可以上调整合素β3的表达，且DENV E蛋白与整合素β3在HMEC-1内存在很明显的共定位现象，利用RNAi技术下调整合素β3的表达可明显抑制病毒的进入[8]，推测整合素β3可能是DENV入侵宿主细胞受体或共受体。但目前没有直接证据证明E蛋白与整合素β3之间的相互作用。因此，本研究应用Octet系统对重组E蛋白与可能受体整合素β3的亲和力进行分析，初步研究了E蛋白与整合素β3之间的相互作用。GM-CSF在JEV prME DNA疫苗诱导的免疫应答中起抑制作用[9]，但其在DENV蛋白免疫中的作用尚不清楚。为此，本研究的第二部分工作是原核表达系统表达E蛋白，纯化DENV-2重组E蛋白后，对其免疫原性进行分析，同时设置GM-CSF佐剂组，研究GM-CSF在DENV E蛋白免疫中的作用。最后，我们利于实验室已经构建好的DENV prME、NS1+2a蛋白的真核表达质粒对动物的免疫保护作用进行了研究，希望能为DENV疫苗的研究奠定基础。具体实验结果如下：一、DENV-2E蛋白的原核表达及免疫原性研究1. DENV-2E蛋白的表达与纯化以pReceiver-E重组质粒(本室保存)为模板，扩增目的基因E胞外区基因片段，构建重组质粒E/pGEX-6P-1，转化BL21菌，诱导表达，并摸索得到可溶性蛋白表达量相对较高的表达条件：诱导物IPTG浓度0.5mM，诱导温度20℃，诱导时间为15h；亲和层析纯化重组E蛋白，最后得到纯度较高的蛋白。2.重组E蛋白免疫原性研究免疫6周龄的BALB/c雌鼠，设置E蛋白组、E+pCAG-GM组、GST和生理盐水组。三次免疫2周后，断尾取血，ELISA法测定各组抗体效价；PRNT50检测血清的抗DENV-2中和抗体效价；ELISpot法检测脾细胞因子INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-17水平。结果显示：重组E蛋白组抗体效价为1:3,200，中和抗体效价为1;320；而E+pCAG-GM组抗体效价为1:6,400，中和抗体效价为1:1,280，说明E蛋白可以诱导产生特异性抗体和中和抗体；E，E+pCAG-GM组IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17水平明显上升，与生理盐水组比较差异显著（p<0.05）。由于IL-2和IFN-γ为Th1型细胞因子，IL-4和IL-10为Th2型细胞因子，IL-17为Th17细胞产生的细胞因子。细胞因子水平变化说明E蛋白组和E+pCAG-GM组诱导了Th1、Th2和Th17途径的免疫应答反应。3.重组E蛋白对小鼠的保护作用同上方法免疫6周龄的BALB/c雌鼠，设置E蛋白组、E+pCAG-GM组、GST和生理盐水组。三次免疫2周后，颅内注射1,000PFU的DENV-2，观察小鼠死亡情况。结果为E+pCAG-GM组、GST组和生理盐水组小鼠全部死亡，E蛋白组存活率为33.33%；结果说明，重组E蛋白有一定的免疫保护作用，pCAG-GM有抑制E蛋白诱导的免疫应答的作用。二、Octet系统分析DENV-2E蛋白与整合素β3的亲和力运用基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉技术（BLI，BioLayerInterferometry）进行重组E蛋白与整合素β3的分子间的动力学分析，以确定重组E蛋白与整合素β3之间亲和力的强弱和特异性。Octet系统分析显示重组E蛋白与整合素β3平衡解离常数(KD)为3.14×10-9M，解离速率常数(Kdis)为5.11×10-5s-1。提示重组E蛋白与整合素β3的相互作用表现为易结合、难解离的特点，说明重组E蛋白与整合素β3有较强的特异性亲和力。三、 prME及NS1+2a DNA的小鼠免疫原性研究1. prME和NS1+2a DNA的免疫原性研究6周龄BALB/c雌鼠分别免疫E蛋白、 E+pRe-prM-E、pRe-prM-E+pRe-NS1-NS2a，生理盐水组注射等量生理盐水。小鼠三次免疫2周后， ELISA的方法测定各组抗体效价；PRNT50检测血清的抗DENV-2中和抗体效价； ELISpot法检测脾细胞因子INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17水平。结果：E蛋白组抗体效价是1:3,200，中和抗体效价为1:320；E+pRe-prM-E组为1:800，中和抗体效价为1:160；pRe-prM-E+pRe-NS1-NS2a组，抗体效价最高，可达到1:12,800，中和抗体效价也是最高为1:2,560，并且pRe-prM-E+pRe-NS1-NS2a组INF-γ、IL-10和IL-17因子水平明显高于其他组（p<0.05）；IL-4因子水平，各组间差异不显著。细胞因子水平说明pRe-prM-E和pRe-NS1-NS2a同时诱导了Th1和Th2途径，且Th17途径也参与了免疫应答过程；结果说明pRe-prM-E+pRe-NS1-NS2a组诱导的免疫应答水平明显优于其它组。2. prME和NS1+2a DNA对小鼠保护作用的研究将6周龄BALB/c雌鼠分别免疫E蛋白、 E+pRe-prM-E、pRe-prM-E+pRe-NS1-NS2a，生理盐水组注射等量生理盐水。三次免疫2周后，颅内注射1,000PFU的DENV-2，观察小鼠死亡情况。攻毒后第13d后，生理盐水组小鼠全部死亡；E蛋白组和E+pRe-prM-E组均在第12d出现死亡，最终存活率均为33.3%；而联合免疫质粒pRe-prM-E与pRe-NS1-NS2a组，整个实验过程小鼠均未见任何发病症状，存活率为100%。结果说明，pRe-prM-E和pRe-NS1-NS2a质粒联合免疫小鼠后，对小鼠的保护作用最好，可考虑作为候选DNA疫苗的分子靶点。综上，本实验结果证明了E蛋白DENV在感染过程中的重要作用，动物实验表明同时免疫prME和NS1+2a DNA可以能够达到100%的免疫保护，可考虑作为候选疫苗的分子靶点。本研究为进一步研究DENV疫苗奠定了一定的基础。