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利用Y-射线诱变技术,中国科学家张集文研究员和日本学者MoriK先后分别从光/温敏籼稻不育系w6154S和粳稻常规种农林8号的突变后代中获得了苯达松敏感致死材料8077S和农林8号M。利用该致死突变位点标记光/温敏籼稻不育系或一般质不育系,在苗期通过喷施一定浓度的苯达松溶液,可以去除不育系自交种子,保证杂交制种纯度。过去的研究表明,两个敏感突变体均受一对隐性基因基因控制,分别被命名为bel和bs!,利用SSR标记同时被定位在第三染色体上,分别距离SSR标记RMl68为7.1cM和SSR标记RM3856为14.1cM。本研究在前期的研究基础上,对敏感致死位点进行了精细定位,通过基冈互补和反义抑制,最终分离克隆了该基因。同时,利用RT—PCR技术,分析了该基因的表达特性。获得的主要研究结果如下:
1.敏感性实验表明,8077S和农林8号M对lOOmg/L的苯达松就具有一定敏感性,两者的敏感性均比相应野生型的敏感性要低60倍左右;同时,农林8号M又比8077S要更敏感;
2.等位性实验表明,来自两个不同突变体的突变位点互相等位;
3.利用SSR标记将致死位点精细定位在SSR标记3a和7a之间,其遗传距离分别为0.1cM和0.4cM,进一步分析发现,致死位点与PCR—RFLP标记DP1和DP2共分离;
4.生物信息学分析表明,该致死位点可能与细胞色素P450基因有关,并确定了四个P450基因为候选基因。进一步对四个候选基因进行测序比较分析表明,其中一个P450基因,即CYPSM6基因,在8077S和农林8号M中,由于该基因在不同的外显子上出现了单碱基缺失,造成基冈翻译的移码突变,致使该基因的功能尚失;
5.将该基因全片段(含启动子、基因编码序列和终止子)导入突变体8077S中,转化后代恢复了对苯达松和磺酰脲类除草剂的抗性;
6.而将该基因的反义片段导入野生型w6154S中,则使转化后代对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感致死。