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背景:造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)被广泛应用于实验室基础医学研究及临床血液病的移植治疗。本实验室在之前的研究中,筛选优化出一种体外扩增高效培养扩增HSC的方案(Hematopoietic expansion medium,HEM),并且在免疫缺陷小鼠体内证实了扩增获得的HSCs具有多系分化和长期植入造血潜能。由于HSC具有自我更新和多系分化潜能,将HSC在体外诱导分化大规模制备红细胞是提供一种血液替代品,应对临床血液供应不足的潜在解决方案。目的:结合本实验室已有的研究工作基础,本论文围绕HSC体外安全高效扩增及向红细胞的定向诱导分化展开研究,旨在非人类灵长类大动物体内进一步评价扩增后获得的HSCs的功能性和安全性,并为体外大规模诱导HSC分化制备红细胞应用于临床输血提供临床前研究资料。方法:1.首先收集食蟹猴动员后外周血,分离富集CD34+造血干细胞,并将HEM应用于食蟹猴造血干细胞扩增。在体外通过集落形成实验和流式免疫表型分析鉴定经HEM扩增的CD34+的多系分化能力及HSCs特征;食蟹猴(共11只)接受环磷酰胺给药处理,造成骨髓抑制模型;用GFP病毒标记体外扩增后的细胞用于自体移植,移植分组如下:空白对照组(n=3,移植时给予生理盐水),阴性对照组(n=3,移植时给予自体CD34-细胞),实验组(n=5,给予扩增后的自体CD34+细胞移植)。在移植术后,定期抽取食蟹猴静脉血,进行血常规测定及流式分析等,观察动物的造血系统恢复情况,综合评价移植进入猴体内的造血干细胞的功能性和安全性。2.从人O型脐带血中分离富集造血干细胞,在HEM的基础上,我们继续优化因子配方并尝试用滚瓶培养体系完成红细胞定向诱导分化的体外中试规模制备,并对体外制备获得的红细胞的安全性、有效性、稳定性进行研究,包括体外研究(细胞表型、基因组稳定性与细胞周期、血红蛋白含量及功能性评价、体外储存稳定性等)和体内研究(免疫缺陷小鼠及非人灵长类动物食蟹猴体内的输注研究)。结果:1.食蟹猴CD34+细胞可经HEM扩增达到移植数量要求,集落形成能力实验显示扩增后CD34+细胞保持了多系分化能力。实验组食蟹猴(给予自体CD34+细胞移植)在骨髓抑制后的血象恢复明显快于对照组(移植时给予生理盐水或CD34-细胞),在移植后一个月可在食蟹猴骨髓和外周血中的淋巴系和髓系细胞中均可检测到GFP+细胞,且接受移植的食蟹猴在移植术后全部健存,在随后长达18个月的跟踪检测中未出现肉眼可见病变。2.运用滚瓶培养系统对人脐血造血干细胞进行定向诱导分化21天,总细胞扩增可超过2 × 108倍,该产量相当于单份脐带血(约5 × 106个CD34+细胞作为起始)经过体外分化培养可获得500个输血单位所含红细胞量。体外制备的人晚幼红细胞,CD235a表达90.1 ± 6.2%,脱核率50 ± 5.7%,具备和人正常外周血相当的血红蛋白和氧合功能,在免疫缺陷小鼠体内可进一步分化为终末成熟的无核红细胞,且在失血性贫血猴体内输注后可发挥携氧功能,改善猴贫血症状。结论:1.经HEM扩增后的CD34+细胞经自体移植到骨髓抑制的食蟹猴体内后,对食蟹猴的血象恢复有促进作用,并具备向髓系和淋巴系分化的能力,及植入食蟹猴骨髓的能力。本研究验证了 HEM体外高效扩增CD34+细胞用于临床前大动物自体移植的安全性和有效性,为体外扩增后的人造血干细胞移植应用于临床治疗提供了临床前研究参考资料。2.在HEM的基础上进一步优化建立了一个用于CD34+造血干细胞体外扩增并定向诱导分化成红细胞的培养技术体系,该培养体系包括使造血干细胞高效扩增及分阶段定向诱导红系分化的因子组合配方,和滚瓶中试规模放大培养系统。首次实现了造血干细胞定向分化为红细胞的中试规模制备,并通过一系列体外和小鼠及食蟹猴体内实验完成了体外制备红细胞的临床前研究,验证了体外制备的红细胞的安全性和有效性,为体外红细胞产业化制备从实验室走向临床研究提供了数据支持和参考。