[研究背景]随着国家经济的快速发展,国民生活方式的巨大改变,我国糖尿病患病率正呈快速上升趋势。据中华医学会糖尿病分会2008年公布的调查结果,我国成人糖尿病的患病率已超过9%,糖调节受损的患病率已接近15%。糖尿病俨然已经成为患者和社会的巨大负担。随着糖尿病病程的延长,其慢性并发症也日益增多,其中糖尿病肾病(DN)是糖尿病最主要的慢性并发症之一,亦是1型糖尿病患者致死的主要原因。近些年来,随着糖尿病发病率的逐年上升,DN在世界范围内已成为引起终末期肾脏疾病(End-stage renal disease,ESRD)的首要原因。据相关数据统计,在我国,DN也已成为继慢性肾炎之后引起ESRD的第二大原因。DN的发病机制目前尚不明确,其基本病理改变是肾小球基底膜增厚,系膜细胞增生和细胞外基质蓄积。高糖可通过多条途径引起肾脏损害,众多学者认为多种因素共同作用导致了DN的发生。大量研究证实,糖尿病时,肾脏存在活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)堆积,如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢、一氧化氮等,肾脏组织内原有的氧化还原动态平衡被破坏,因此,诱导了肾组织的氧化应激反应,介导了DN的发生与发展。大量研究显示,高糖状态时,体内发生着明显的氧化应激反应,但高血糖状态下引起ROS蓄积的确切原因目前尚不清楚,以往观点认为可能与糖的自身氧化,蛋白质的非酶糖基化、多元醇通路被激活,蛋白激酶C (protein kinaseC,PKC)的活化,抗氧化系统清除能力下降等因素有关。最近有研究表明,高糖诱导的ROS主要产生于线粒体,高血糖首先引起细胞内线粒体ROS生成增多,导致线粒体功能紊乱,进而激活氧化应激相关的通路,再活化其下游途径,导致组织受损。线粒体是细胞内能量合成的重要场所,80%～90%的ATP在线粒体呼吸链氧化磷酸化过程中生成。线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,通过和电子传递链相耦连的氧化磷酸化反应将ADP和无机磷酸合成ATP,ROS产生于电子经NADH或FADH2通过电子传递体传递给分子氧的呼吸作用的过程中。分子氧作为电子传递链过程中电子与质子氢的末端受体,能促发化学氧化的过程,并与一个电子相结合使其生成超氧阴离子,从而再形成羟自由基。由于线粒体DNA位于呼吸链周边,无法避免遭受氧化损伤,因而形成恶性循环,氧化损伤被放大。氧化磷酸化过程中也可产生ROS,线粒体既是ROS产生的主要场所,也是ROS攻击的主要部位,线粒体功能状态的好坏对细胞功能有着直接的影响。线粒体ROS生成过多可能为糖尿病慢性并发症的共同发生机制。因此,保护线粒体的结构的完整性和一定的活力,避免线粒体氧化损伤,可成为防治糖尿病慢性并发症的新方向和研究药物的重要突破点。由于ROS具有高度的反应性,可以与周围物质迅速发生反应,检测较为困难,故体内氧化应激的定量描述主要根据于ROS与脂质、DNA、蛋白质反应后的氧化代谢产物和体内抗氧化酶的测定,可通过检测MDA、GSH、SOD的含量来间接反应氧化应激损伤的程度。国内外大量研究证明,众多抗氧化剂能治疗糖尿病患者体内发生的氧化损伤反应,如谷胱甘肽、Vit、α-硫辛酸、辅酶Q10、生物类黄酮等。另外近来发现临床常用药物,如噻唑烷二酮类、瑞格列奈、他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、钙离子通道阻滞剂兼有较强的抗氧化活性,为DN的治疗开拓了新的方向,并且上述药物单用或联用还具有降低血糖、降低血压、调节血脂和抗炎等多种功效,在治疗DN方面有十分广阔的前景。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)作为新近发现的降糖药物,在糖尿病的治疗中起着举足轻重的作用,GLP-1是一种主要由位于回肠和结肠的Langerhans细胞分泌,十二指肠和空肠的L细胞也有少量分泌的具有30个氨基酸的多肽,其是胰高血糖素原前体基因的产物,该基因编码由160个氨基酸组成的肽类前体。是目前所知最强的葡萄糖依赖型的胰岛素分泌促进激素。GLP-1是第一个被描述的肠促胰岛素(incretin),是一种进餐时由胃肠道系统生成的肽类物质,具有促进胰腺p细胞葡萄糖依赖性的释放胰岛素的功能。除此之外,GLP-1还具有降低血浆中的胰高血糖素水平,减低胃排空的速度,增强饱食感及刺激胰岛B细胞的增殖与分化等多种生理活性,这些特性使众多学者认为GLP-1可能成为未来2型糖尿病的最佳治疗药物,日益成为糖尿病治疗新药物研究的热点。GLP-1通过与GLP-1受体(GLP-1receptor, GLP-1R)结合并发挥生物学效应,它是一个与G蛋白偶联的7个跨膜结构,细胞内通过cAMP传递信号,GLP-1在调节胰岛素及胰升血糖素分泌、调节食欲、胃肠功能稳态方面起到了重要的功能。GLP-1的分泌功能的异常就有可能导致代谢的紊乱,众多研究已证实2型糖尿病的发生与GLP-1分泌减少相关。近来文献报道GLP-1在糖尿病肾病治疗中起到一定的治疗作用,GLP-1受体在体内分布广泛,除胰岛细胞外还在心脏、肺组织中也发现有GLP-1受体的表达,具有舒张血管、降低血压及保护内皮细胞功能。部分动物实验提示可刺激肝脏即骨骼肌细胞中糖原的合成,还发现中枢神经系统中的多个部位有GLP-1受体存在,但主要存在于丘脑,在脑室中注入GLP-1可抑制食物及水的摄入。同时GLP-1受体也广泛分布于肾小球系膜细胞,GLP-1类似物艾塞那肽(Exendin-4)与GLP-1氨基酸序列具有53%同源,是GLP-1受体的激动剂,且不易被被体内的二肽基肽酶Ⅳ (DPP-Ⅳ)降解,有文献报道GLP-1类似物艾塞那肽能够延缓糖尿病肾病的进程,同时发现高糖状态下经艾塞那肽干预的人肾小球系膜细胞转化生子因子β1和结缔组织生长因子的表达亦相应减少,GLP-1类似物利拉鲁肽能够减少1型糖尿病大鼠尿蛋白的含量。目前,国内外有关GLP-1减轻糖尿病肾病机制的研究报道极少,我们设想用GLP-1干预高糖培养的肾小球系膜细胞,观察干预后氧化应激指标变化,探讨GLP-1对高糖培养的肾小球系膜细胞保护作用的机制。[目的]研究高糖对体外培养大鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖和氧化应激,并进-步探讨不同浓度GLP-1对肾脏的保护作用。[方法]1.将肾小球系膜细胞按如下分组培养：正常糖组(5.5mmol/L),高糖组25mmol/L),高糖+GLP-1(3nmol/L)组,高糖+GLP-1(10nmol/L)组,高糖+GLP-1(30nmol/L)组,高糖+GLP-1(100nmol/L)组,分别培养24h。2.CCK8试剂盒法测细胞增殖率。3.流式细胞仪法测细胞活性氧(ROS)分别以二氯氢化荧光素(DFCH-DA)标记细胞,通过流式细胞仪监测细胞内二氯荧光黄(DCF)的荧光强度而测得细胞内ROS水平。4.酶标仪法测细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)含量,比色法测丙二醛(MDA)含量。[结果]1.与正常糖组对比,高糖组肾小球系膜细胞增殖率增高(P<0.05)。2.与正常糖组对比,高糖组细胞内DCF平均荧光强度升高(P<0.05)。3.与正常糖组对比,高糖组SOD及GSH含量下降(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05)。4.干预组,给予GLP-1(3nmol/L)干预高糖组细胞内DCF平均荧光强度无明显影响(P>0.05),给予GLP-1(10-100nmol/L)可使高糖组细胞内DCF平均荧光强度下降(P<0.05),但给予GLP-1(10nmol/L与30nmol/L)组下降无明显区别(P>0.05)。5.干预组,给予GLP-1(3nmol/L)干预高糖组细胞上清液中SOD、GSH、MDA含量无明显影响(P>0.05),给予GLP-1(10-100nmol/L)可使高糖组细胞内SOD、GSH含量升高,MDA含量下降(P<0.05),但给予GLP-1(10nmol/L与30nmol/L)组GSH、SOD、MDA含量无明显区别(P>0.05)。[结论]低浓度的GLP-1对高糖培养的肾小球系膜细胞的增殖及高糖诱导的氧化应激无明显作用,高浓度的GLP-1能改善高糖对肾小球系膜细胞的损害作用,GLP-1对肾小球系膜细胞的保护作用具有浓度依赖性。