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目的:E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一个小分子量糖蛋白,前期的研究已经证实在心肌肥大和心肌纤维化中CREG过表达能够改善心功能,但CREG对心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)损伤的作用未见报道。后续研究发现,CREG作为溶酶体相关蛋白,可能参与调控溶酶体的形成。因此,本文的目的是阐明CREG能否通过调控自噬溶酶体发生,改善MIR损伤。方法:(1)在南方动物模型研究中心购买CREG基因半敲除的小鼠模型即CREG杂合子(CREG+/-)小鼠,在本实验室继续饲养、繁殖。C57BL/6(CREG+/+)小鼠由沈阳军区总医院动物实验科提供。(2)通过CREG+/+小鼠皮下埋微渗透泵给予外源性重组CREG蛋白(re CREG)(0.3 mg/kg·day)建立CREG过表达组小鼠模型即re CREG+/+小鼠,通过给予溶酶体抑制剂Chloroquine(CQ,10 mg/kg·day)建立自噬损伤小鼠模型。(3)应用上述不同组小鼠模型通过结扎前降支缺血30 min,再灌注不同时间,建立小鼠MIR模型。(4)应用腺病毒载体和干扰RNA方法转染H9C2心肌细胞,建立CREG过表达和低表达的H9C2心肌细胞培养模型。(5)应用小动物超声仪于再灌注28 d检测各组小鼠的心功能,TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色检测心肌缺血情况。(6)应用RT-PCR方法检测CREG m RNA水平的表达。(7)应用蛋白印迹方法(western blot)和原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡的情况。(8)应用western blot和免疫荧光染色的方法检测自噬相关蛋白的表达。结果:通过western blot和RT-PCR方法研究发现,MIR后15 min开始,正常CREG+/+小鼠心肌中CREG蛋白的表达逐渐下降,2 h基本消失。CREG的m RNA水平无明显改变。在CREG+/-小鼠心肌中CREG蛋白表达下降更为明显(P<0.05)。在re CREG蛋白治疗组中,re CREG+/+小鼠心肌中CREG蛋白未见显著下调。应用小动物超声仪检测小鼠MIR 28 d时的心功能发现:与CREG+/+小鼠相比较,CREG+/-小鼠的心功能损伤更为严重(P<0.05),而re CREG+/+小鼠心功能改善比较明显(P<0.05)。MIR 24h行TTC染色观察到CREG+/-小鼠的心肌坏死面积最大(P<0.01),给予re CREG蛋白能够改善CREG+/+小鼠心肌受损现象,这些结果提示CREG能够改善MIR损伤时的心肌损伤,明显改善心功能。与CREG+/+小鼠相比较,MIR后CREG+/-小鼠心肌凋亡现象严重(P<0.01),而re CREG+/+小鼠心肌细胞凋亡改善(P<0.01);免疫荧光染色和western blot结果证实CREG+/-小鼠MIR早期自噬功能损伤严重,而给予re CREG蛋白时能够激活自噬通路。这些结果表明CREG参与凋亡和自噬的调控作用。为进一步证实CREG是否通过调控自噬通路对抗心肌细胞凋亡,我们在给予re CREG蛋白的同时给予溶酶体抑制剂CQ(10 mg/kg·day),TUNEL染色和western blot分析发现,抑制心肌自噬后,给予re CREG蛋白干预组心肌细胞凋亡较自噬未抑制组明显加重(P<0.05)。小动物超声仪检测28 d的心功能发现:给予re CREG蛋白并同时给予CQ组小鼠的心功能较单独给予re CREG蛋白组明显恶化。这些研究提示,CREG可能通过调控自噬激活作用保护缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)引起的细胞凋亡,从而保护心功能。为深入探讨CREG调控自噬的分子机制,我们应用腺病毒和干扰RNA转染分别建立了CREG过表达(Ad CREG)和低表达(si CREG)的大鼠心肌细胞H9C2体外培养模型。分别给予早期自噬激动剂Resveratrol(Res,10μmol/L)和CQ(10μmol/L),然后饥饿处理细胞后,观察CREG对心肌细胞凋亡和自噬的调控作用。结果表明:Ad CREG组细胞凋亡较Ad GFP对照组减少,同时,心肌细胞自噬功能活跃;给予CQ后心肌自噬功能受到抑制,细胞凋亡明显加重(P<0.01);与CREG正常表达的对照组相比,si CREG心肌细胞自噬发生障碍,细胞凋亡严重,应用Res后不能改善心肌细胞凋亡现象(P<0.01),而对照组给予Res后心肌细胞凋亡减轻,自噬被激活。这些结果在细胞水平再次证实了CREG通过调控自噬对抗心肌细胞凋亡。进一步应用透射电镜观察到,给予饥饿刺激后Ad CREG细胞中自噬体和溶酶体形成增加(P<0.01);而si CREG细胞中自噬体显著堆积,溶酶体形成显著减少(P<0.01)。Lysotracker染色结果同样提示CREG过表达促进了细胞内溶酶体数量的增加,而CREG的缺乏使溶酶体的生成减少。并且,si CREG细胞中溶酶体膜蛋白LAMP1/LAMP2、溶酶体内蛋白水解酶cathepsin D/cathepsin L表达下降(P<0.01),而Ad CREG细胞中这四种蛋白显著增多。这些发现说明了CREG可能参与了溶酶体的发生及功能,激活自噬通路。甘露糖-6-磷酸受体(Mannose 6-phosphate receptors,M6P/IGF2R)是重要的溶酶体酶转运受体,促进溶酶体的成熟发育。IGF2R也是CREG的受体,因此,我们假设在CREG参与溶酶体发生及成熟的过程中,IGF2R发挥重要的作用。研究发现,si CREG细胞中IGF2R蛋白的表达量较对照组和Ad CREG组明显增多;免疫荧光染色和免疫共沉淀检测到CREG的缺乏降低了IGF2R与LAMP2、cathepsin D的相互结合能力,减少了溶酶体酶的转运;而CREG过表达则提高了IGF2R与LAMP2、cathepsin D的结合能力。结果提示CREG与IGF2R相互作用,促进溶酶体的成熟。结论:CREG通过促进溶酶体发生及功能,激活自噬,对抗心肌细胞凋亡,保护MIR损伤引起的心功能障碍。