【摘 要】
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随着现代生物工程技术的发展,利用生物酶催化生产复杂化合物在实际生产领域种发挥了越来越重要的作用。而在诸多手性分子中,双酮、双醛、醛酮类化合物占据了一席之地,如重要
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随着现代生物工程技术的发展,利用生物酶催化生产复杂化合物在实际生产领域种发挥了越来越重要的作用。而在诸多手性分子中,双酮、双醛、醛酮类化合物占据了一席之地,如重要的降血脂药物他汀等。酿酒酵母醛酮还原酶(Gre2)是一种常见的醛酮还原酶,它对许多醛酮类物质都具有良好的催化能力,尤其是将双醛、双酮、醛酮类物质。通过Gre2,能够高效的催化产生手性药物中间体或者药物有效分子。而葡萄糖脱氢酶(GDH)是一种生物体内非常常见并且广泛用于酶催化工艺中的蛋白酶。它广泛参与了多种辅酶/还原性辅酶(NADP/NAPDH)依赖性酶催化体系。通过向其他酶供氢使得反应持续高效进行。在本论文中,首先通过基因工程技术,将Gre2与GDH基因一同连接在质粒表达载体上并转化进入感受态大肠杆菌内,利用菌落PCR技术以及酶切验证确认连接完成,诱导大肠杆菌表达双酶剪接体蛋白,双酶剪接体蛋白能够通过内含肽剪接效应在胞内完成自剪接过程,获得Gre2-GDH剪接体酶蛋白,证明能够在大肠杆菌中进行表达并发生自剪接形成稳定的双酶系统。在双酶剪接体表达系统的基础上,充分利用磷酸缓冲液与锌离子的配位效应,完成双酶蛋白的剪接工作,获得双酶剪接体。并利用扫描电镜(SEM),能谱分析(EDS),二维红外(2D-IR)等手段研究双酶剪接体的表征,用气象色谱(LC)探究该体系的酶活与催化能力。酶催化实验表明,与游离混合双酶相比较,双酶剪接体Gre2-GDH的效率提高了 2倍多。通过在PBS中与锌配位作用,对双酶剪接体Gre2-GDH进行了固定。固定酶对保持了游离双酶剪接体Gre2-GDH的活性。
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