一、背景和目的:胶质瘤（glioma）是颅内最常见的肿瘤,其特性是侵袭性生长到正常脑组织,手术切除的程度受限,术后反复复发,仍是神经外科的难点之一。影响脑胶质瘤侵袭性生长的因素主要包括:胶质瘤自身的生物学特性、血管生成、胶质瘤细胞所处微环境、及胶质瘤与机体免疫系统间的相互作用等。尽管胶质瘤高度侵袭的生物学行为已被广泛接受,但至今尚无一种特异针对胶质瘤侵袭性的临床治疗方法,除表皮生长因子受体的单克隆抗体有一定治疗作用外,其他如:整合素抑制剂、金属基质蛋白酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂等均未表现出良好的临床治疗效果。因此,恶性胶质瘤侵袭性生长的机制尚需进一步探讨。自脑胶质瘤形成之时起,肿瘤细胞已侵袭到距离瘤体3⁵ cm以外,缺氧、代谢、占位效应、趋化、手术刺激等多种因素均可诱导肿瘤脱离瘤体向正常脑组织侵袭,导致难以对肿瘤进行彻底治疗。能否有一种方法,克服这些将肿瘤向正常脑组织“推”的力量,而将侵袭到脑组织的肿瘤细胞“拉”回到瘤体附近,然后进行切除等治疗?可能成为治疗脑胶质瘤的新策略,改进治疗效果,尤其是对于涉及功能区的胶质瘤,若能在手术前使肿瘤细胞“撤退”出功能区,将可能在更彻底切除肿瘤的基础上,更好地保留神经功能。为进一步探讨恶性胶质瘤侵袭机制,本课题研究了Caveolin-1（Cav1）、氧自由基（reactive oxygen species, ROS）及机体免疫状态在脑胶质瘤生长和侵袭中的作用。为寻找新的治疗思路与策略,本研究建立了直流电场（direct current electric fild, DCEF）作用下体外观察细胞运动的装置;观察了DCEF对体外培养的U87脑胶质瘤细胞迁移的影响,探讨了其分子机制和信号通路。以期为进一步阐明脑胶质瘤的侵袭性生长机制,研究脑胶质瘤综合治疗策略提供新的思路和方向。二、材料和方法:（1）采用免疫组织化学及RT-PCR的方法观察27例不同级别人脑胶质瘤中Cav1的表达和分布情况,通过随访病人无进展生存期（progression free survival,PFS）分析Cav1的表达与病人预后之间的关系;（2）应用甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin,MβCD）降低Cav1水平或RNA干扰下调C6脑胶质瘤细胞Cav1表达;采用“划痕”实验和Transwell的方法检测细胞体外迁移和侵袭;应用Western-blot的方法检测EGFR和Pyk2的改变。（3）构建慢病毒颗粒感染U87脑胶质瘤细胞上调或下调Cav1表达;应用流式细胞技术检测细胞的生长周期,应用MTT方法检测肿瘤细胞的生长曲线;采用“划痕”实验和Transwell的方法检测细胞体外迁移和侵袭。（4）应用U87脑胶质瘤细胞内质粒转染的方法使锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）过表达至3.5倍;应用DCFH-DA或HE对U87脑胶质瘤细胞染色后用荧光酶标仪检测细胞内ROS的产生;用还原剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine, NAC）预处理30 min或过表达mCAT降低细胞内过氧化物水平;采用“划痕”实验和Transwell的方法检测细胞体外迁移和侵袭;采用Western-blot的方法检测细胞中Akt,s6-ribosomal protein,Erk1/2和JNK总蛋白及其磷酸化水平;应用Akt特异抑制剂LY294002和Erk特异抑制剂PD98059分别抑制Akt和Erk的活化。（5）采用G422小鼠胶质瘤脑内种植的方法建立Bal b/c小鼠（免疫功能正常）、裸小鼠（Nude Mice,T细胞免疫缺陷）、补体C3基因敲除小鼠（C3-KO Mice,补体功能缺陷）等三种不同免疫背景小鼠脑胶质瘤模型;比较三者的生存时间,肿瘤生长速度;采用流式细胞术检测肿瘤组织内CD₆₈⁺淋巴细胞浸润;应用ELISA的方法检测肿瘤组织内TNF-α和IFN-γ的含量。（6）自行设计和建立稳定、实用、可实时动态观察DCEF作用下细胞生物学行为的系列设备及技术方法。（7）采用倒置显微镜实时动态观察并记录U87脑胶质瘤细胞在DCEF作用下的运动;应用蛋白芯片观察60个与细胞运动相关蛋白的磷酸化水平;应用DCFH-DA或HE对U87脑胶质瘤细胞染色后用荧光酶标仪检测DCEF作用后细胞内ROS的产生情况;采用JC-1染色的方法动态监测DCEF作用后线粒体膜电位;质粒转染的方法过表达MnSOD、mCAT或使用还原剂NAC预处理30 min降低细胞内超氧化物或过氧化物水平;采用Western-blot的方法检测细胞内Akt、Erk 1/2、JNK和p38等总蛋白及其磷酸化水平。三、主要结果:1、Caveolin-1,ROS及机体免疫状态在脑胶质瘤生长和侵袭中的作用（1）Cav1蛋白和mRNA在正常脑组织及WHO分级Ⅰ级脑胶质瘤中表达较低,Ⅱ级脑胶质瘤中表达差异较大,而在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中表达明显增高;肿瘤中Ki67阳性细胞的数量≥10个/HF的病人Cav1基因表达明显高于<10个/HF的病人;27例不同级别脑胶质瘤病人Cav1基因测序未见突变位点。Cav1低表达的病人,无进展生存期（PFS）明显优于Cav1高表达的病人;低表达的病人平均PFS为28.40±9.49 m,中位PFS为30 m;高表达的病人平均PFS为9.08±7.01 m,中位PFS为7 m。（2）MβCD降低Cav1水平或RNA干扰下调Cav1表达后,大鼠C6胶质瘤细胞体外迁移和侵袭能力均下降;Cav1水平下降同时伴有EGFR和Pyk2的表达减少。采用慢病毒感染U87脑胶质瘤细胞上调或下调Cav1表达,对肿瘤细胞的生长周期和生长曲线无明显影响;在10% FBS的培养条件下干扰Cav1表达后,体外迁移和侵袭能力增强,Cav1过表达后迁移和侵袭能力下降;在0.1% FBS的培养条件下干扰Cav1表达后迁移和侵袭能力降低,Cav1过表达后迁移和侵袭能力增强。（3）U87脑胶质瘤细胞内MnSOD过表达至3.5倍后,U87脑胶质瘤细胞中H2O2明显升高而超氧化物水平明显降低;NAC预处理U87脑胶质瘤细胞30 min或过表达mCAT后,H2O2和超氧化物水平均明显降低。过表达MnSOD后U87脑胶质瘤细胞的体外迁移和侵袭能力明显增强,NAC预处理和mCAT过表达致H₂O₂下降后,可使过表达MnSOD的U87脑胶质瘤细胞的体外迁移和侵袭能力下降。过表达MnSOD后U87脑胶质瘤细胞中Akt,s6-ribosomal protein,Erk1/2和JNK的活化明显增强,MMP-1和MMP-9的表达水平升高,可被10 mM的NAC预处理、过表达mCAT阻断;应用Akt特异抑制剂LY294002和Erk特异抑制剂PD98059,可使过表达MnSOD的U87脑胶质瘤细胞的体外迁移和侵袭能力下降。（4）建立了Bal b/c小鼠、裸小鼠、补体C3基因敲除小鼠等三种不同免疫背景小鼠脑内G422胶质瘤种植模型。Bal b/c小鼠脑内种植G422胶质瘤后肿瘤生长最慢,平均生存期最长（44.3±6.0 d）,裸小鼠肿瘤生长次之,平均生存期缩短（24.8±5.2 d）;补体C3基因敲除小鼠肿瘤生长最快,平均生存期最短（18.6±5.8 d）。三种不同免疫背景小鼠脑内种植G422胶质瘤后肿瘤组织内CD₆₈⁺淋巴细胞浸润无明显差异;但肿瘤组织内TNF-α的含量,裸小鼠为28.11±4.86μmol/L,C3基因敲除小鼠为22.87±6.36μmol/L,明显低于BALB/c小鼠230.21±39.17μmol/L;肿瘤组织内IFN-γ的含量,BALB/c小鼠最高180.76±29.19μmol/L,裸小鼠次之为113.46±23.76μmol/L,C3基因敲除小鼠最低为16.84±4.45μmol/L。2、DCEF诱导体外培养U87脑胶质瘤细胞定向迁移的作用及机制（1）建立了稳定、实用、可实时动态观察直流电场下细胞生物学行为的系列设备及技术方法,包括:细胞爬片、观察小室、底座、琼脂胶盐桥、封闭式电极交换瓶及电源等;一次加入培养基后,3 h内温度、pH及电流稳定,可满足本实验的应用。（2）无DCEF的作用时,细胞往各个方向运动的数量基本相当,平均Cosineθ为0.16±0.02;在200 mV/mm的DCEF作用120 min的观察时间内,U87脑胶质瘤细胞向负极定向迁移,平均Cosineθ为0.72±0.12;DCEF作用180 min后可观察到细胞均呈垂直于电场的方向有序排列。（3）DCEF作用于体外培养的U87脑胶质瘤细胞30 min后,应用蛋白芯片所观察的60个与细胞运动相关的蛋白中,54个蛋白质的磷酸化水平升高,其中磷酸化水平超过1.5倍的抗体19个,MAPK和PI3K信号通路活化明显。（4）200 mV/mm的DCEF作用于体外培养U87脑胶质瘤细胞后,15min即可诱导ROS明显升高,30 min达到高峰,60 min仍维持较高水平;ROS的产生随DCEF的增加而升高;DCEF可诱导线粒体膜电位持续升高;NAC可以有效阻断DCEF诱导的ROS生成,并阻断DCEF诱导的U87脑胶质瘤细胞的定向运动;过表达MnSOD可阻断DCEF诱导的超氧化物升高并阻断DCEF诱导的细胞定向运动,过表达CAT可明显抑制DCEF诱导的过氧化物的升高但对DCEF诱导的细胞向负极定向运动无明显影响。（5）200 mV/mm DCEF刺激U87脑胶质瘤后,p-Akt,p-Erk 1/2,p-JNK和p-p38水平在30 min内明显升高,随DCEF增大而活化增强;NAC或过表达MnSOD可以有效阻断DCEF诱导的Akt,Erk 1/2,JNK和p38的活化,过表达CAT可明显抑制JNK和p38活化,但对Akt和Erk1/2的活化无明显影响。（6） 200 mV/mm DCEF作用于U87脑胶质瘤细胞后,可诱导细胞内p-Erk 1/2,和Cav1在细胞内的极性分布,但是对Erk 1/2总蛋白的分布无明显影响。四、结论:本课题研究了Cav1、ROS及机体免疫状态在脑胶质瘤生长和侵袭中的作用;建立了DCEF作用下体外观察细胞运动的系列装置,观察了DCEF对体外培养的U87脑胶质瘤细胞迁移的影响并探讨了其分子机制和信号通路。结论如下:1、Cav1在高级别脑胶质瘤中的表达显著增高,Cav1的表达越高,病人的预后越差;Cav1在脑胶质瘤细胞侵袭和迁移中的作用具有细胞差异并受肿瘤细胞生长环境的影响。2、U87脑胶质瘤细胞内过表达MnSOD后,细胞内H2O2水平升高可通过活化细胞内PI3Ks、MAPKs等信号通路以及上调MMPs表达促进肿瘤细胞的体外迁移和侵袭。3、具有不同免疫背景的小鼠脑内种植G422小鼠胶质瘤后,机体的不同免疫状态虽然对肿瘤内CD68⁺淋巴细胞浸润无明显影响,但可影响TNF-α和IFN-γ等细胞因子的释放,从而影响脑胶质瘤的生长。4、应用本实验建立的设备和技术方法,可稳定、方便地实时动态观察DCEF作用下细胞的生物学行为。5、200 mV/mm DCEF可诱导体外培养的U87脑胶质瘤细胞向负极定向迁移;DCEF可诱导细胞内超氧化物水平升高,超氧化物则可诱导Akt和Erk1/2等细胞通路活化及Cav1等信号分子极性分布,在DCEF诱导的U87脑胶质瘤细胞骨架重组及定向运动中起关键作用。本课题研究探讨了Cav1、ROS、生物电场及机体免疫状态在脑胶质瘤侵袭中的作用,丰富了对脑胶质瘤侵袭性生长机制的认识,可为抗胶质瘤侵袭治疗提供新靶点;发现DCEF可诱导体外脑胶质瘤的定向迁移并探讨了其分子机制和信号通路,提出DCEF可能具有将侵袭到脑组织的肿瘤细胞“拉”回至瘤体然后进行更彻底治疗的潜力,为寻找脑胶质瘤治疗新策略提供了思路和方向。