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目的通过对血小板冻干预处理液配方的筛选、冻干血小板保存的稳定性研究及其止血功能初步评价,以期解决血小板的冻干保存问题,实现血小板的常温保存,为血小板的拓展应用奠定基础。方法首先,本课题进行了血小板冻干预处理液配方的筛选。采用正交设计法进行实验设计,以冻干血小板复水化后血小板回收率、平均血小板体积(mean platelet volume,MPV)冻干前后差值和血小板相对聚集率为评价指标,考察冻干预处理配方中海藻糖浓度、可逆性血小板激活抑制剂及蛋白质类保护剂3因素对血小板冻干保存的影响,每个因素选3个水平,用正交表L9(34)进行设计,分为9个实验组。每组3袋汇集血小板,各组分别用相应的配方预处理后,进行预冻和冻干。冻干血小板室温下保存1d后进行复水化检测。用正交设计优选出的最优配方组合处理3袋汇集血小板,与正交试验9组进行比较,评价指标为血小板回收率、MPV冻干前后差值、血小板相对聚集率,来验证最优配方的可靠性,并观察最优配方处理后的冻干血小板透射电镜下超微结构与冻干前血小板的异同。同时选择两组其他血小板冻干预处理液配方处理血小板后进行冻干,与优选的配方进行初步比较,以血小板回收率和MPV冻干前后差值为评价指标,来检验正交设计最优配方的冻干效果。其次,对冻干血小板保存温度和稳定性进行了研究。用筛选出的最优配方冻干保存6袋汇集血小板,分别置于-20℃、4℃和室温下密封保存,选取5个时间点——Od、10d、30d、90d、180d进行检测,以血小板回收率、MPV冻干前后差值、血小板相对聚集率,以及血小板激活后PDGF-BB、VEGF、TGF-β释放量作为评价指标。再次,选择室温保存90d的冻干血小板进行动物止血实验研究,初步探讨冻干血小板的止血效果。选SD大鼠15只,制作肝损伤出血和股静脉损伤出血模型,随机分3组,分别为空白对照组、云南白药组和冻干血小板组。在造模成功后,立即撒药粉,并进行按压止血,以创面止血时间和出血量为监测指标,评价冻干血小板对SD大鼠肝出血和股静脉出血的止血效果。结果血小板冻干预处理液配方的筛选结果显示:正交试验9组,各组冻干血小板复水化后血小板回收率均波动在(75.4±3.7)%～(87.7±2.4)%之间,MPV冻干前后差值波动在(1.9±0.4)f1～(3.0±0.3)f1之间,血小板相对聚集率波动在(29.0±4.2)%～(81.1 ±9.6)%之间。方差分析结果显示:海藻糖浓度对冻干血小板三个评价指标的影响均有显著性差异(P<0.05);可逆性血小板激活抑制剂对血小板回收率的影响差异有显著性(P<0.05),对MPV冻干前后差值和血小板相对聚集率影响无显著性差异(P>0.05):蛋白质类保护剂对三个指标的影响均无显著性差异(P>0.05)。根据多因素正交设计直观分析和方差分析结果综合评价得出血小板预处理最优组合为A3B1C2。验证实验结果显示:最优配方组(G0)冻干血小板复水化后血小板回收率为(91.0±4.0)%,与正交试验T1、T2、T3、T5、T6、T8、T9组相比较,差异有显著性意义(P<0.05),但与T4、T7组相比,结果无显著性差异(P>0.05);MPV冻干前后差值为(2.0±0.3)f1,与正交试验T1、T2、T3、T5组相比,差异有显著性意义(P<0.05),但与T4、T6、T7、T8、T9组相比,结果无显著性差异(P>0.05);复水化后血小板相对聚集率为(80.8±6.3)%,与正交试验T1、T2、T3、T4、T5、T6、T9组相比较,差异有显著性意义(P<0.05),但与T7、T8组相比,结果无显著性差异(P>0.05);透射电镜下血小板超微结构显示:与冻干前血小板相比,复水化后冻干血小板有轻微肿胀,但细胞膜结构基本完整,胞内颗粒仍保留,结构与冻干前血小板类似。最优配方组(G0)与其他预处理配方之一(G1)及空白对照组(G3)比较,冻干血小板复水化后血小板回收率之间的差异有统计学意义(P<0.01),与另一预处理配方(G2)之间差异没有统计学意义(P>0.05);G0组与G1组之间MPV冻干前后差值有显著性差异(P<0.01),与G2、G3组MPV冻干前后差值无显著性差异(P>0.05)。冻干血小板保存温度和稳定性研究结果显示:用最优配方处理的冻干血小板分别在保存Od、10d、30d、90d和180d时复水化检测,-20℃保存组、4℃保存组和室温保存组三组之间,同一时间点,血小板回收率无显著性差异(P>0.05);血小板相对聚集率无显著性差异(P>0.05);血小板激活后上清中VEGF含量无显著性差异(P>0.05),TGF-β含量无显著性差异(P>0.05)。在同一时间点检测,三组之间血小板MPV无显著性差异(P>0.05),但均与冻干前血小板MPV有显著性差异(P<0.05);血小板激活后上清中PDGF-BB含量三组之间无显著性差异(P>0.05),但保存10d、30d、90d、180d时三组与冻干前血小板有显著性差异(P<0.05)。SD大鼠肝出血模型止血时间:空白组为(4.49±0.59)min,云南白药组为(2.08±0.50)min,冻干血小板组为(1.63士0.26)min;出血量:空白组为(0.755±0.182)g,云南白药组为(0.312±0.166)g,冻干血小板组为(0.293±0.131)g。方差分析结果显示,在SD大鼠肝组织止血时间和出血量方面,冻干血小板组、云南白药组与空白对照组相比,均具有显著性差异(P<0.05);而冻干血小板组与云南白药组比较,无显著性差异(P>0.05)。SD大鼠股静脉出血模型止血时间:空白组为(5.42±1.09)min,云南白药组为(2.67士0.64)min,冻干血小板组为(1.94±0.27)min;出血量:空白组为(1.125±0.239)g,云南白药组为(0.636±0.235)g,冻干血小板组为(0.598±0.146)g。方差分析结果显示,在SD大鼠股静脉出血模型止血时间和出血量方面,冻干血小板组、云南白药组与空白对照组相比,均具有显著性差异(P<0.05);而冻干血小板组与云南白药组比较,无显著性差异(P>0.05)。结论综上所述,在冻干工艺固定的情况下,冻干预处理配方中海藻糖浓度、可逆性血小板激活抑制剂对血小板冻干保存均有影响,而本课题选择的两种蛋白质类保护剂对血小板冻干效果没有影响。筛选出的预处理配方——基础液加50mmol/L海藻糖、1μg/ml PGE1和30%蛋白质类保护剂a对血小板冷冻干燥能起到较好的保护作用。优选配方预处理后冻干的血小板在室温下保存与置于4℃和-20℃保存效果相当,冻干血小板室温下可以稳定保存至少6个月。在SD大鼠出血模型止血方面,冻干血小板具有与云南白药相近的止血功能。