目的:　　 脂肪组织在能量储存、物质代谢和内分泌等过程中发挥着重要的生物学作用。脂肪细胞分化异常(肥胖与分化不良)与胰岛素抵抗发生密切相关。肥胖是一种慢性代谢性综合症,肥胖者机体常处于慢性氧化应激和炎症状态。活性氧在脂肪细胞分化过程中的作用已开始引起科学界的关注,但确切机制目前仍不清楚。核转录因子NF-E2相关因子2(NRF2)属于CNC碱性亮氨酸拉链蛋白家族成员,是启动细胞抗氧化反应的主要调控因子。本实验室前期研究发现,NRF2基因敲除小鼠体重明显低于野生型,抵抗高脂饮食诱发的肥胖,脂肪组织中PPARγ蛋白水平明显降低。同时发现,小鼠3T3-L1细胞和人皮下前脂肪细胞NRF2基因沉默后,分化能力明显减弱,PPART蛋白水平明显低于对照组。基于前期的研究结果,本研究中我们进一步探索NRF2调控PPARγ表达的机制,加深对氧化应激与脂肪细胞分化之间关系的认识。　　 砷是国际肿瘤研究机构(IARC)确认的人类致癌物。长期砷暴露可引发多脏器损伤,甚至导致皮肤、肺和膀胱等部位的癌症。大量流行病学调查资料显示,砷暴露与2型糖尿病发病密切相关。目前已有文献报道,砷能够降低脂肪细胞PPARγ蛋白水平,阻碍PPARγ与其受体之间的相互作用,最终抑制脂肪细胞分化。尽管如此,砷抑制脂肪细胞分化的确切机制仍不清楚。本研究从砷降低脂肪细胞PPARγ蛋白水平的现象入手,从氧化应激和内质网(ER)应激两个方面,探索砷在脂肪细胞分化早期抑制PPARγ表达的机制。　　 方法:　　 1、细胞培养与分化应用含10％小牛血清、50 units/ml青霉素和50μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基,于37℃C和5％CO2条件下培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞。每隔2或3天更换培养基。待细胞汇合达到80％-90％时,应用胰酶/EDTA处理,传代继续培养。　　 向含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(50 units/ml)和链霉素(50μg/ml)的高糖DMEM培养基中添加地塞米松(Dex)、异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和胰岛素(Insulin)三种物质,配制成“DMI”分化培养基,为提高分化培养基诱导能力,可继续向“DMI”分化培养基中补充罗格列酮(Rosi)和吲哚美辛(Indo),后者简称为“DMI-RI”分化培养基。　　 2、建立NRF2和KEAP1基因沉默的前脂肪细胞模型采用购自Sigma公司的MISSION短发卡RNA(shRNA)慢病毒颗粒建立细胞系。选择于3-5天内能够将全部正常前脂肪细胞杀死的嘌呤霉素浓度配制选择培养基。将针对基因NRF2,KEAP1或非针对性的Scramble(Scr)阴性对照的病毒颗粒转导至小鼠3T3-L1前脂肪细胞系。步骤为:将正常3T3-L1细胞接种于6孔板内,待细胞汇合至40％-50％时,向细胞中分别添加海美溴铵(HB)和病毒颗粒。次日将培养基换成含有嘌呤霉素(Puromycin)的培养基,筛选细胞,建立Scr、NRF2和KEAP1基因稳定沉默的细胞模型。　　 3、细胞活力测定(MTS)应用MTS方法检测亚砷酸钠(NaAsO2)的急性细胞毒性。步骤如下:将细胞按1×104个/孔接种于96孔板内,置于细胞培养箱24小时后,弃掉培养基,应用含有不同浓度砷的培养基继续培养24小时或48小时,之后应用非放射性细胞增殖检测试剂盒检测细胞活力。结果用砷暴露组细胞活力占对照组细胞活力的百分比表示,并制作细胞活性线性图形。　　 4、油红染色(Oil-red O Stainning)参照Hotamisligil实验室方法:弃去细胞培养基,PBS冲洗细胞3次,于0.5％戊二醛中固定5分钟,在摇床上用PBS连续冲洗3次,每次5分钟。弃去PBS后,使用60％的异丙醇冲洗一次,加入油红染料,摇床上震荡30分钟之后60％异丙醇再冲洗一次,PBS冲洗一次,加入PBS留待显微镜观察、照相或扫描。　　 5、Western Blot免疫印迹简要步骤如下:收集处理后的细胞,提取总蛋白或核蛋白。使用BCA或Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。经过蛋白稀释,变性,电泳,转膜,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,显色和扫描后分析蛋白表达情况。　　 6、mRNA提取与实时定量PCR(RT-PCR)分析引物应用Primer Express软件(Applied Biosystem公司)设计,由MWG-Biotech公司合成。应用TRIzol(Invitrogen公司)提取细胞总mRNA,使用Nanodrop定量mRNA浓度,使用MuLV逆转录酶、OligodT和dNTP将总mRNA逆转录为cDNA。应用SYBR Green试剂盒(Applied Biosystem公司)进行RT-PCR扩增,检测相关基因转录水平。　　 7、抗氧化反应元件(ARE)报告基因活性检测应用含HB与病毒颗粒的培养基建立ARE活性报告细胞模型,使用嘌呤霉素配制选择培养基。荧光素酶活性测定采用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega公司),按照试剂盒说明书操作。细胞活力测定采用非放射性细胞增殖检测试剂盒(Promega公司)测定。　　 8、染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)分析应用EZ ChIP试剂盒(Upstate Biotechnology公司)。按照产品说明书,简要步骤如下:处理,交联,预清除,免疫沉淀,解交联,PCR扩增,DNA电泳,扫胶,分析实验结果。　　 9、质粒构建与突变根据文献设计一系列由5端不断剪切的不同序列长度的插入片段,构建C/EBPβ启动子驱动的荧光素酶活性报告质粒。-1036bp、-556bp、-218bp、-116bp和-m116bp片断由MWG-Biotech合成。在-m116插入片断,ARE核心“GC”位点替换成“AA”。荧光素酶活性的测定采用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega公司),按照试剂盒说明书操作。　　 10、细胞内GSH及GSSG水平的测定按照Bioxytech GSH/GSSG-412试剂盒(OxisResearch公司)说明书进行测定。　　 11、质粒提取质粒提取应用GenElute HP Plasmid Midiprep试剂盒,并按照产品说明书操作。　　 12、转染　　 转染应用FuGENE(R) HD Transfection Reagent试剂盒,并按照产品说明书操作。　　 13、统计与分析应用统计软件Graphpad Prism5(Graphpad software公司)进行数据处理与分析。所有数据表示为平均值±标准误。两组间比较采用Students t检验。多组间单个变量比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA),而后用Bonferroni法进行两两比较。当p＜0.05时认为具有统计学差异。　　 结果:　　 1、建立小鼠3T3-L1细胞NRF2和KEAP1基因沉默模型RT-PCR与Western结果显示NRF2基因沉默(NRF2 KD)细胞与KEAP1基因沉默(KEAP1 KD)细胞的目标基因表达水平显著低于野生型细胞。　　 2、砷对NRF2 KD细胞的急性细胞毒性当亚砷酸钠浓度≥5μM时,与Scr和KEAP1 KD细胞相比,NRF2 KD细胞对亚砷酸钠急性毒性更加敏感。　　 3、NRF2及KEAP1基因沉默对脂肪细胞分化能力的影响与Scr细胞相比,NRF2 KD与NRF2及KEAP1基因共同沉默(Double KD)细胞分化能力减弱,而KEAP1 KD细胞分化能力则明显增强。　　 4、NRF2基因沉默对分化相关基因转录水平的影响分化前8小时内,与Scr细胞相比,NRF2 KD细胞CREB、C/EBPβ和PPARγ1和PPARγ2转录水平明显降低,而C/EBPδ转录水平明显升高。　　 分化7天内,NRF2 KD细胞C/EBPα、PPARγ、aP2、Adiponectin和Glut4转录水平明显低于Scr细胞。　　 5、NRF2-ARE通路在分化诱导过程中的活化脂肪细胞分化早期(诱导分化后第4小时)和后期(诱导分化后第7天)分别有一个ARE活性高峰。DMI和DMI-RI诱导条件下的ARE活性变化趋势完全一致。　　 脂肪细胞分化过程中,GSH水平的变化趋势与ARE活性变化趋势基本一致,并且NRF2 KD细胞在诱导分化后GSH水平低于Scr细胞。　　 Scr细胞在诱导分化后第2小时和第4小时,核内NRF2蛋白蓄积到最高水平。NRF2 KD细胞核内NRF2蛋白水平始终低于Scr细胞。　　 6、NRF2基因沉默对几种主要分化调控因子表达的影响与NRF2下游蛋白GCLC和HO1一样,C/EBPβ和PPARγ1表达高度依赖于NRF2,但其它脂肪细胞分化调控蛋白C/EBPδ、KLF5和KROX20的水平则不依赖于NRF2。　　 7、NRF2对C/EBPβ的转录调控DMI处理细胞10小时,检测报告基因活性发现:介于-1036bp和-116bp之间(使ARE位点保持完整)的序列剪切,对报告基因没有明显的抑制效应,说明-116bp～0bp区域是调控C/EBPβ转录的主要DNA序列。ARE位点被人工突变后,-116bp报告基因活性～97％被抑制。　　 8、NRF2在分化早期对其它分化调控因子表达的影响。　　 与Scr细胞相比,NRF2 KD细胞CREB和p-CREB蛋白水平降低,其它蛋白如MafG/F/K、c-Jun和c-Fos表达水平无明显差异。　　 9、NRF2蛋白与C/EBPβ启动子区域的相互作用分析NRF2蛋白能够与C/EBPβ启动子区域的DNA序列结合。　　 10、砷对前脂肪细胞的急性毒性作用在正常培养和分化条件下染砷48小时,当亚砷酸钠浓度超过10μM时,小鼠3T3-L1前脂肪细胞活性明显降低。　　 11、砷对脂肪细胞分化能力的影响亚砷酸钠对小鼠3T3-L1细胞的分化抑制作用主要发生在早期(诱导分化后前2天)。亚砷酸钠对3T3-L1细胞分化的抑制作用呈明显的剂量-效应关系。　　 12、砷对脂肪细胞分化过程中相关蛋白水平的影响DMI诱导分化后24小时,砷处理组细胞C/EBPα和PPARγ蛋白水平开始明显低于对照组。砷处理组细胞诱导分化早期,CHOP10蛋白水平并未随时间延长而降低,反而在12小时出现高峰。　　 诱导分化8小时过程中,3T3-L1细胞C/EBPβ和C/EBPδ蛋白水平在砷处理组与对照组间无明显差异。砷处理组细胞CHOP10蛋白水平从4小时起明显高于对照组。　　 13、砷对脂肪细胞ER应激通路相关蛋白水平的影响砷能有效激活ER应激通路,上调p-eIF2α、ATF4和CHOP10蛋白水平,并且呈现明显的剂量-效应关系。　　 以5μM亚砷酸钠处理3T3-L1细胞12小时过程中,除eIF2α、XBP1和ATF6α外,BIP、p-eIF2α、ATF4和CHOP10蛋白水平均随着时间的延长而升高,呈现明显的时间-效应关系。　　 14、砷对脂肪细胞NRF2表达的影响随着染砷浓度的升高,3T3-L1细胞NRF2 mRNA水平相应升高。　　 15、NRF2对脂肪细胞CHOP10表达的影响正常条件下或使用NRF2激活剂(tBHQ和SFN)处理后,与Scr细胞相比,NRF2KD细胞CHOP10蛋白水平明显降低,mRNA水平无明显差异。砷处理后,与Scr细胞相比,NRF2 KD细胞CHOP10蛋白水平无明显差异,mRNA水平则显著升高。　　 结论:　　 1、NRF2基因沉默增加脂肪细胞对亚砷酸钠急性毒性的敏感性。　　 2、NRF2基因沉默明显抑制脂肪细胞分化能力,而KEAP1(NRF2的显性抑制因子)基因沉默则增强脂肪细胞分化能力。　　 3、NRF2可能通过与C/EBPβ启动子中ARE位点结合转录调控C/EBPβ的表达。　　 4、亚砷酸钠可能通过上调CHOP10蛋白水平抑制脂肪细胞分化。　　 5、亚砷酸钠可以通过氧化应激与ER应激两条通路上调CHOP10蛋白水平,但以ER应激途径为主。