背景:卵巢癌及宫颈癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤,其中卵巢癌的致死率高居妇科肿瘤的首位,而宫颈癌的发病率则位列妇科肿瘤第一。针对这两种妇科肿瘤,除手术和放疗外,化疗也是一种重要的治疗措施。目前,以顺铂为基础的联合化疗方案应用最为广泛,但其副作用较大,效果也尚不理想。近年研究表明,肿瘤也是一种代谢异常疾病,通过调节代谢抗肿瘤已成为肿瘤治疗领域中的新研究热点之一。在多种肿瘤中,靶向关键代谢通路均可显著杀伤肿瘤细胞。在诸多通过调节代谢发挥抗肿瘤作用的药物中,二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA,通常指二氯乙酸钠)显示出良好的抗肿瘤前景。二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA)是一种临床上用于代谢紊乱性疾病及治疗心血管疾病的药物。近年研究表明,DCA对多种肿瘤细胞具有杀伤作用,但对正常细胞无损害。DCA的作用机制主要是通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK),使其底物丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)磷酸化水平降低从而活性升高,促进糖代谢中间产物丙酮酸更多地进入线粒体三羧酸循环,从而增强葡萄糖有氧氧化,抑制糖酵解,进而抑制乳酸生成。DCA的这种作用可以逆转肿瘤细胞中线粒体的功能紊乱,激活线粒体依赖的细胞凋亡,从而杀伤肿瘤细胞;同时减少乳酸堆积,破坏肿瘤细胞赖以生存的微环境,从而抑制肿瘤细胞的生存。然而,我们的前期研究发现,DCA在杀伤卵巢癌细胞的同时,上调了抗凋亡蛋白Mcl-1(myeloid cell leukemia sequence 1)的水平,在杀伤宫颈癌细胞的同时,上调了环氧合酶2(cyclooxygenase2,COX2)的水平,从而导致卵巢癌及宫颈癌细胞对DCA不敏感,其具体机制及解决措施尚不明确,亟待探讨。本研究中,为解析卵巢癌及宫颈癌细胞对DCA不敏感的具体机制及解决措施,在体内和体外开展了两部分研究工作:第一部分:二氯乙酸盐与二甲双胍协同杀伤卵巢癌细胞的分子机制研究目的:探讨二甲双胍与二氯乙酸盐联用是否可协同杀伤卵巢癌细胞以及其分子机制,研究卵巢癌细胞抵抗二氯乙酸盐的分子机制,以及在卵巢癌移植瘤动物模型中两药联用是否具有同样的效果。方法:1.通过CCK8实验明确二甲双胍与DCA是否可协同杀伤卵巢癌细胞,用流式细胞技术、Western blot以及Caspase3活性检测试剂盒检测两药联用后是否可促进卵巢癌细胞的凋亡。2.用二甲双胍和DCA分别以及联合处理卵巢癌细胞后Western blot检测凋亡抵抗分子Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL的表达水平。利用RNAi技术干扰Mcl-1后再用DCA处理细胞,检测细胞增殖、凋亡情况。构建Mcl-1的过表达载体,转染卵巢癌细胞后再用二甲双胍和DCA处理,检测细胞增殖与凋亡情况以进行回复实验。3.用qPCR的方法鉴定DCA对Mcl-1的转录水平是否有影响。用翻译抑制剂放线菌酮(CHX)预处理处理细胞后再加入DCA,检测Mcl-1的表达水平。检测与Mcl-1蛋白稳定性相关的磷酸化分子p-ERK和p-JNK,使用U0126抑制p-ERK后检测DCA对Mcl-1蛋白的水平影响以及对卵巢癌细胞的杀伤效应。Western blot方法检测二甲双胍是否对p-ERK的表达有影响。在使用蛋白酶体抑制剂MG132后检测二甲双胍对Mcl-1表达水平的影响。4.用Western blot方法检测DCA和二甲双胍对细胞自噬的影响,在卵巢癌细胞中过表达GFP-LC3质粒后,DCA和二甲双胍处理进一步佐证两药对自噬的影响。5.DCA和二甲双胍处理细胞后,检测培养基中葡萄糖和乳酸的含量。用线粒体应激检测试剂盒检测DCA与二甲双胍对卵巢癌线粒体呼吸速率的影响。6.Western blot实验验证DCA和二甲双胍对PDH和其磷酸化水平的影响。RNAi干扰PDH后检测对二甲双胍诱导的乳酸堆积的影响。转染PDK的过表达载体后,联用DCA与二甲双胍,检测其对卵巢癌细胞的杀伤作用。7.建立卵巢癌移植瘤动物模型,验证DCA与二甲双胍协同杀伤卵巢癌的作用。结果:1.DCA与二甲双胍可协同杀伤多种肿瘤细胞,在卵巢癌细胞中效果较好,两药联用组较单一用药组凋亡小体的数量、Cleaved-PARP的表达水平以及caspase 3的活性明显升高。在卵巢癌移植瘤动物模型中两药联用效果同样明显。2.单独使用DCA时,抗凋亡分子Mcl-1上调,干扰Mcl-1后DCA杀伤卵巢癌细胞的水平明显升高而过表达Mcl-1则抑制了DCA和二甲双胍联合杀伤卵巢癌细胞的作用;DCA上调Mcl-1的机制是通过上调p-ERK和p-GSK-3β从而增强Mcl-1蛋白的稳定性,而联用二甲双胍后可通过抑制mTOR的磷酸化进而抑制Mcl-1蛋白的翻译水平而降低了DCA诱导的Mcl-1上调。3.DCA处理细胞后在诱导Mcl-1的上调同时,还促进了卵巢癌细胞的自噬水平,当使用自噬抑制剂后再用DCA处理,细胞的凋亡水平显著升高。而二甲双胍与DCA联用后较DCA单独使用时,自噬水平降低。4.使用二甲双胍处理细胞后,会明显诱导乳酸堆积以及葡萄糖消耗过多,而联用DCA后则可抑制这种现象。线粒体应激实验证实DCA可促进线粒体呼吸速率,从而抑制二甲双胍诱导的乳酸堆积和葡萄糖消耗过多。DCA可抑制PDH的磷酸化水平,干扰PDH同样可抑制二甲双胍诱导的乳酸堆积,而过表达PDK后,两药联用组细胞的凋亡水平则降低。结论:DCA与二甲双胍可促进细胞凋亡进而协同杀伤卵巢癌细胞。单独使用DCA时,可上调抗凋亡分子Mcl-1的表达以及诱导保护性自噬,从而导致卵巢癌细胞抵抗DCA的杀伤效果,而联合使用二甲双胍后则可抑制DCA诱导的Mcl-1的上调和保护性自噬,进而促进DCA的杀伤效果;二甲双胍在单独使用时,可导致乳酸堆积和葡萄糖消耗过多,从而营造了适宜肿瘤细胞生存的酸性微环境,当联合使用DCA后,DCA通过抑制PDK从而使其底物PDH活性升高,最终促进葡萄糖的有氧氧化,抑制糖酵解,进而抑制乳酸生成。DCA和二甲双胍可相互弥补不足,达到协同杀伤卵巢癌细胞的效果。本研究率先证实DCA与二甲双胍联用可以相互增敏对方的抗卵巢癌效应,明确了DCA与二甲双胍相互增敏的主要机制,为探索和设计基于DCA联合二甲双胍通过调节代谢而抗卵巢癌的新措施提供了科学依据。第二部分:抑制COX2可增强DCA对宫颈癌细胞的化疗敏感性的机制研究目的:在宫颈癌细胞及移植瘤动物模型中研究二氯乙酸盐对宫颈癌细胞的作用以及DCA上调COX2的分子机制,并探寻解决措施。方法:1.用实时细胞电子分析系统及CCK8实验检测不同浓度的DCA对宫颈癌细胞的杀伤效果,Western blot及q PCR方法检测DCA处理后COX2和炎症相关因子的表达水平。2.使用COX2抑制剂塞来昔布或RNAi干扰COX2后用DCA处理细胞,细胞电子分析系统、CCK8、流式细胞技术、Western blot等方法检测DCA对宫颈癌细胞的杀伤作用。3.利用生物信息学构建COX2基因启动子区质粒,荧光素酶报告基因实验检测DCA是否通过促进COX2启动子活性进而上调COX2的转录水平。DCA处理宫颈癌细胞后用转录抑制剂放线菌素D(Act D)处理细胞2h、4h、6h、8h、10h,PCR方法检测COX2的表达水平。4.Western blot方法检测可能影响COX2 m RNA降解的RNA结合蛋白QKI、Hu R、CUGBP2、TTP,验证DCA是否影响这类RNA结合蛋白的水平。转染QKI6的过表达质粒后DCA处理细胞,Western blot、q PCR检测COX2的表达,流式细胞技术、CCK8检测其对宫颈癌细胞的杀伤作用。5.构建宫颈癌移植瘤动物模型,用DCA和塞来昔布处理裸鼠,观察在移植瘤动物模型抑制COX2是否可增加宫颈癌细胞对DCA的化疗敏感性。结果:1.实时细胞电子分析系统及CCK8实验证实高浓度的DCA可杀伤宫颈癌细胞,同时DCA上调了COX2以及炎症相关因子如IL1β、IL6、IL8和TNFα的表达。2.当使用塞来昔布或干扰COX2后,较单独使用DCA时显著促进了宫颈癌细胞的凋亡进而增强了DCA杀伤宫颈癌细胞的作用。3.荧光素酶报告基因实验和转录抑制实验证实DCA并不影响COX2的启动子活性,而是通过抑制COX2 m RNA的降解从而上调COX2的水平,其具体机制是通过抑制RNA结合蛋白QKI的表达从而抑制COX2 m RNA的降解。4.在移植瘤动物模型中,用塞来昔布抑制COX2后可明显增加DCA对宫颈癌的化疗敏感性。结论:DCA在高浓度时可杀伤宫颈癌细胞,因此宫颈癌细胞对DCA不敏感,其原因是DCA诱导了COX2及炎症相关因子的表达从而抵抗其杀伤作用。当使用COX2抑制剂或干扰COX2后可明显增强宫颈癌细胞对DCA的敏感性。DCA上调COX2的机制是通过转录后调控实现,通过抑制RNA结合蛋白QKI的表达进而增强COX2 m RNA的稳定性,从而上调COX2的表达。本研究探讨了DCA新的抵抗因素,并为宫颈癌的治疗提供了新策略。