【摘 要】
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鸡球虫病是由于艾美耳球虫入侵肠道细胞而引发的肠道细胞疟原虫疾病。不同的艾美耳球虫寄生在鸡的肠道的不同部位,宿主感染艾美耳球虫后会引起宿主的肠道出现不同程度的损伤,感染严重时会引起宿主的死亡。本研究从抗病育种的角度出发,探究宿主与球虫之间的互作关系,为进一步研究鸡抵御球虫感染的相关分子机制提供一定的参考依据。本研究通过对4周龄的ROSS 308商品代肉鸡进行混合球虫卵囊的攻毒,攻毒7天后根据病变程度
【基金项目】
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国家自然科学基金国际合作项目（31761143014）；
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鸡球虫病是由于艾美耳球虫入侵肠道细胞而引发的肠道细胞疟原虫疾病。不同的艾美耳球虫寄生在鸡的肠道的不同部位,宿主感染艾美耳球虫后会引起宿主的肠道出现不同程度的损伤,感染严重时会引起宿主的死亡。本研究从抗病育种的角度出发,探究宿主与球虫之间的互作关系,为进一步研究鸡抵御球虫感染的相关分子机制提供一定的参考依据。本研究通过对4周龄的ROSS 308商品代肉鸡进行混合球虫卵囊的攻毒,攻毒7天后根据病变程度选择两尾样,进行法氏囊组织的m RNA测序,分析ROSS 308肉鸡品系在感染艾美耳球虫后法氏囊组织的m RNA差异表达情况,寻找影响抗球虫感染的候选基因。主要的研究结果如下:1.在对ROSS 308商品代肉鸡进行混合球虫卵囊的攻毒7天后,统计攻毒组与对照组的粪便卵囊数,并对实验个体进行病变评分以及血清中IL-10含量的检测。经统计,攻毒处理组中的粪便卵囊数远高于对照组;攻毒处理组的肠道病变评分极显著高于对照组（P<0.01）;血清IL-10的含量检测显示攻毒组要高于对照组。综合以上分析,表明此次对ROSS 308商品代肉鸡的艾美耳球虫攻毒处理是有效的,可用于后续的测序实验。2.RNA-seq结果表明:法氏囊组织在球虫攻毒处理后有347个基因的m RNA表达量存在显著差异（P<0.05,FC≥1.5）,225个基因上调,122个基因出现下调。经GO功能富集分析发现,差异基因主要与细胞膜、细胞膜部分、细胞质、离子结合、催化活性和膜的整体组成成分等过程。KEGG通路富集分析表明:差异基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体互作通路、细胞粘附分子通路和氨基酸合成与代谢相关通路。结合以上分析,推测TNFRSF6B基因在抗鸡球虫感染的免疫反应中有一定作用。3.通过RT-PCR和Elisa技术检测与单核巨噬细胞活化相关基因的表达及其分泌情况,结果表明TNFRSF6B基因能够提高HD11细胞中TLR2A、TLR2B、TLR4、CSF-1和CSF-2在m RNA水平上的表达,促进TLR4、MCP-1和M-CSF的分泌。对巨噬细胞炎症细胞因子的表达与分泌进行检测,结果发现,TNFRSF6B基因能够促进HD11细胞中IL-1B、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12B、IFN-γ和TNF-α的表达,同时抑制IL-4和IL-18的表达;Elisa结果显示,TNFRSF6B的表达对IL-1、IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ具有促分泌作用。对细胞上清中NO的含量进行检测,结果发现TNFRSF6B能够显著地促进单核巨噬细胞中NO的释放,促进HD11细胞的吞噬功能。4.在HD11细胞上进行TNFRSF6B的过表达与干扰,对周期相关基因进行m RNA检测,发现,TNFRSF6B能够抑制周期相关基因的表达;流式细胞术和Ed U的检测结果也表明TNFRSF6B能够抑制细胞的增殖。同时对细胞凋亡相关基因进行检测,RT-PCR结果显示,TNFRSF6B能够有效抑制细胞凋亡相关基因的表达;流式细胞术的结果显示TNFRSF6B的表达能够抑制HD11细胞的凋亡。5.RT-PCR检测过表达和干扰TNFRSF6B基因的HD11细胞中抗原递呈相关基因的表达,结果显示,TNFRSF6B能够下调HD11细胞抗原递呈相关基因的表达;流式细胞术结果也显示TNFRSF6B能够抑制HD11细胞膜表面MHC-Ⅱ的表达。综合上述结果,本研究得出结论:ROSS 308肉鸡在球虫攻毒后,得到347个差异表达基因,结合GO功能注释与KEGG通路分析,推测TNFRSF6B基因可能参与鸡抗球虫病的免疫反应相关;TNFRSF6B基因可以活化HD11细胞,促进HD11细胞的吞噬功能并抑制HD11细胞的抗原递呈功能;TNFRSF6B基因能够抑制HD11细胞的凋亡并抑制HD11细胞的增殖。
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